副干酪乳杆菌对酒精致肝损伤小鼠生长性能和肝脏的影响

胡盼盼

（1.吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033000；2.山西农业大学动物医学学院，山西 晋中 030801）

肝脏可以通过体内酶的新陈代谢对酒精进行生物转化[1]，并通过将酒精排出体外进行解毒，但酒精滥用则可导致肝脏严重的病理改变，引发严重的肝脏疾病，酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）已经成为威胁人类健康的重要原因[2]，对个人和社会造成了不良的影响[3]。ALD可从酒精性肝损伤开始，发展为酒精性肝炎或脂肪变性[4]，并进一步发展为肝纤维化或肝硬化[5]，甚至最终导致肝癌。细胞损伤、炎症、氧化应激等是酒精诱导肝损伤的主要因素[6]，目前针对ALD的治疗手段有限且药物治疗具有明显副作用[7]，针对微生物或天然物质具有较强的抗氧化活性，因此开发保肝护肝的功能食品具有重要意义。

益生菌是有益于人体健康的微生物[8]，具有抗菌、抗癌、抗氧化和抗过敏作用、降低血脂、增强免疫功能[9]，并具有菌株依赖性。乳酸杆菌和双歧杆菌是应用最广泛的益生菌。乳酸菌为革兰氏阳性菌[10]，广泛分布于自然界。近年来，一些菌株被发现还具有其他重要的生物学功能，如抗衰老和抗氧化活性等[10]。实验室前期从新疆马奶酒中自行筛选分离鉴定得到副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L，该菌株具有良好的发酵性能及生物活性，并且已经验证其菌体[11]、胞外多糖[12]、发酵液等具有免疫和抗肿瘤等功能。因此，本研究构建酒精慢性肝损伤小鼠模型，研究副干酪乳杆菌M5L对小鼠生长性能和肝功能的影响，对深入开发乳酸菌保肝功能食品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株及动物

副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L：分离自新疆马奶酒中，由哈尔滨工业大学食品科学与工程系保藏[13]。

雄性昆明小鼠（体质量25～28 g）：北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号SCXK（沪）2017-0011），饲养温度为（21±1）℃，相对湿度为（60±5）%，光照12 h/d。实验室通风良好，小鼠自由摄食及饮水。

1.1.2 试剂

谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒：南京建成生物工程公司；白酒（酒精度56%vol）：汾酒集团有限责任公司；无水乙醇、二甲苯（均为分析纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

Eon型酶标仪：美国BioTek公司；BSA224S型电子称：广东省精密仪器公司；MultiModeⅢa型显微镜：美国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组与给药

小鼠先进行5 d的适应性喂养后，每组10只，随机分成四组：分别为对照组（CON组）、模型组（MOD组）、低剂量副干酪乳杆菌M5L处理组（107CFU/mL，L-M5组）、高剂量副干酪乳杆菌M5L处理组（108CFU/mL，H-M5组）。

副干酪乳杆菌处理组小鼠按0.15 mL/10 g的剂量灌胃副干酪乳杆菌液，对照组、模型组小鼠灌胃给予等体积蒸馏水，处理2 h后对照组给予蒸馏水，其他各组按0.15 mL/10 g剂量灌胃白酒（酒精度56%vol），每天1次，连续28 d。

1.3.2 小鼠体质量的变化

小鼠饲养28 d后，分别记录初始和结束后小鼠的体质量，计算体质量增长率，其计算公式如下：

1.3.3 小鼠胸腺指数和脾脏指数的变化

小鼠饲养28 d后，称体质量，颈椎脱臼处死取出脾脏和胸腺，分别称质量，并计算相应的脏器指数，其计算公式如下：

1.3.4 小鼠肝脏的病理变化

肝脏形态的变化：小鼠饲养28 d后，颈椎脱臼处死，取出小鼠肝脏，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色[14]，显微镜下观察小鼠肝脏的病理变化。

肝功能的变化：小鼠饲养28 d后，颈椎脱臼处死，取出肝组织称质量，加入9倍质量的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，3 500 r/min离心20 min，取上清液，采用试剂盒测定小鼠血清中ALT、AST的含量和肝脏中GSH、SOD、MDA的含量。

1.3.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0.1统计软件统计数据并作图，不同字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠体质量的影响

由表1可知，与对照组相比，模型组、副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠体质量增长率均显著降低（P＜0.05），但与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠体质量增长率明显升高（P＜0.05），由此说明副干酪乳杆菌M5L能够促进小鼠的生长，这可能是由于副干酪乳杆菌M5L具有保护小鼠肠胃，提高机体性能，从而使小鼠饮食量增加的缘故[8]。

表1 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠体质量的影响Table 1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on body weight of mice with alcoholic liver injury

2.2 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠免疫系统功能的影响

胸腺和脾脏是机体主要的免疫组织，参与机体细胞免疫和体液免疫，可以有效激活T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞参与免疫反应，因此可以根据胸腺指数和脾脏指数衡量小鼠的免疫功能[14]。由表2可知，与对照组相比，模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数均显著减小（P＜0.05），说明酒精伤害小鼠免疫组织的发育。与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠的胸腺指数均明显增加（P＜0.05），且呈现浓度依赖性，菌体浓度越大，胸腺指数增加越显著（P＜0.05），且高低剂量差异显著（P＜0.05）。对于脾脏指数，低剂量的副干酪乳杆菌处理不能显著的增大小鼠的脾脏指数（P＞0.05），但高剂量组则可以显著的增加小鼠的脾脏指数（P＜0.05），且高低剂量组之间差异显著（P＜0.05）。由此说明，副干酪乳杆菌M5L能在一定程度上改善酒精致小鼠机体免疫组织的伤害。

表2 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠免疫器官的影响Table 2 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on immune organ of mice with alcoholic liver injury

2.3 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠肝功能的影响

2.3.1 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠肝脏形态的影响

由图1可知，对照组小鼠肝脏未见充血、肿胀和炎症现象，肝细胞轮廓清晰，排列整齐；模型组小鼠肝脏出现明显充血肿胀的情况，大量肝细胞堆积在一起，细胞形态严重破坏，低剂量副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠虽然还有一定的充血情况，但形态有所好转，高剂量副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠肝脏炎症显著减小，无充血，肝细胞形态也恢复正常，说明副干酪乳杆菌M5L可以有效的改善小鼠肝脏的病理状态。

图1 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠肝脏形态的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on liver morphology of mice with alcoholic liver injury

2.3.2 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠肝脏功能的影响

谷丙转氨酶是判断肝细胞损伤的重要指标之一，位于肝细胞胞浆内，当细胞损害后，谷丙转氨酶从细胞流入血液，从而导致谷丙转氨酶在外周血清中浓度的升高[15]。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠血清中ALT活性显著增高（P＜0.05），说明酒精造成肝脏严重的伤害。与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠血清中ALT活性显著降低（P＜0.05）。

谷草转氨酶又名天门冬氨酸氨基转移酶，当肝脏受到病理性破坏就会释放到血液中，导致血清中的谷草转氨酶含量越高，肝脏受损程度越严重[9]。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠血清中AST活性显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠血清中AST活性均显著降低（P＜0.05），由此说明副干酪乳杆M5L能改善小鼠肝功能修复能力。

表3 副干酪乳杆菌M5L对酒精性肝损伤小鼠肝脏功能的影响Table 3 Effects of Lactobacillus paracasei M5L on liver function mice with alcoholic liver injury

丙二醛是衡量细胞损伤的重要指标，正常机体中也存在一定含量的MDA，但在脂质过氧化过程中大量产生，还会产生一系列的自由基，从而加剧机体损伤[16]。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠肝脏的MDA含量显著提高（P＜0.05）；与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠肝脏的MDA的含量均显著降低（P＜0.05），说明副干酪乳杆菌M5L可以阻止酒精导致的肝细胞氧化及产生自由基。

机体的氧化平衡需要抗氧化酶的参与，超氧化物歧化酶为活性最强的抗氧化酶。SOD可以清除超氧阴离子自由基，防止脂质过氧化，减轻其对细胞的损害，因此含量越高，说明抗氧化能力越强[17]。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠肝脏的SOD活性显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠肝脏的SOD活性均显著升高（P＜0.05），且呈现浓度依赖性，剂量越大，效果越显著，高低剂量之间存在显著差异（P＜0.05），且显著高于对照组（P＜0.05）。由此说明副干酪乳杆菌M5L具有一定的抗氧化能力。

GSH是组织中一种含巯基的三肽，由半肤氨酸、谷氨酸及甘氨酸组成，GSH代谢过程能参与体内氧化还原过程，能自由基结合，防止细胞破坏，同时还可对抗自由基对肝脏的损害[18]。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠肝脏的GSH含量显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，副干酪乳杆菌M5L处理组小鼠肝脏的GSH含量均显著增加（P＜0.05），甚至显著高于对照组（P＜0.05），说明副干酪乳杆菌M5L抗氧化能力较强，可改善小鼠机体性能。

3 讨论

乙醇是一种很容易穿过细胞膜的小分子[19]，影响乙醇吸收和代谢的因素很多，包括性别、年龄、种族和体质量，低于体积分数10%的乙醇可以直接被肺、肾和汗液排出。乙醇生物转化的主要代谢途径是氧化成乙醛，该过程需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的参与，主要通过乙醇脱氢酶实现，乙醇脱氢酶主要存在于肝脏和胃肠道中[20]，过量饮酒即可引发酒精性肝损伤。KIM N H等[21]给予C57BL/6J小鼠八周酒精处理后发现，小鼠天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的显著升高，小鼠肝细胞受到严重的破坏，脂肪堆积明显，此外产生大量的自由基和炎症因子；LI C等[22]通过给C57BL/6小鼠酒精处理发现，小鼠肝脏受到严重的破坏，大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生。本研究结果与前人研究结果一致，模型组小鼠肝脏MDA含量显著增多，抗氧化酶显著降低，说明酒精肝损伤的确与氧化失衡相关。

乳酸菌作为主要的益生菌，具有抗氧化的作用，能够促进肠道菌群平衡，抑制致病细菌生长，具有生物拮抗作用，其代谢产物参与了机体屏障的构建[23]。实验室前期已经对副干酪乳杆菌M5L体外抗氧化能力进行了测定，结果表明副干酪乳杆菌M5L体外可以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基以及具有较强的还原力，表现出良好的抗氧化活性，且在体内能有效的抑制ROS的产生[24]。此外，大量研究表明乳酸菌可以显著改善酒精导致的肝脏损伤。许女等[25]研究发现，山西老陈醋植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）C181处理，可显著降低慢性酒精诱导昆明小鼠肝脏中甘油三酯和游离脂肪酸的含量，以及血清中AST和ALT的活性；陆婷等[26]采用鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG或MRS培养基将小鼠连续处理4周后再采用体积分数50%的乙醇灌胃，结果发现酒精处理导致小鼠ALT和AST活性显著升高，脂肪合成相关基因表达显著升高，脂肪分解相关基因表达显著降低，经过鼠李糖杆菌LGG处理后呈现不同程度的逆转，表明鼠李糖杆菌LGG具有保护小鼠急性酒精性肝损伤的作用。本研究结果与前人研究结果一致，高低剂量的副干酪乳杆菌M5L干预能够显著改善小鼠的生长性能，并增强小鼠肝脏的抗氧化能力。

4 结论

本研究通过建立酒精性肝损伤小鼠模型，研究了副干酪乳杆菌M5L对小鼠生长性能和肝功能的影响。结果表明，与模型组小鼠相比，副干酪乳杆菌M5L处理后能显著提高小鼠的体质量（P＜0.05），显著增大胸腺指数和脾脏指数（P＜0.05）；减轻小鼠肝脏水肿、充血，肝细胞坏死的情况，并且显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性（P＜0.05），显著降低小鼠肝脏中丙二醛（MDA）的含量（P＜0.05），显著增加小鼠肝脏中超氧化歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）的含量（P＜0.05）。综上，副干酪乳杆菌能够提高酒精致肝损伤小鼠的生长性能，并增强小鼠肝脏的抗氧化能力，对乳酸菌作为保肝护肝功能食品的开发具有重要意义。