米麦曲米酒挥发性风味物质、氨基酸与感官评价的相关性

严 沁，伍文驰，张楷正

（四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000）

善酿酒色泽深黄清亮，香气特盛，酒度适中，口味甜美，酒精度＞12.0%vol，属半甜型黄酒；清酒以大米与天然矿泉水为原料，经过制曲、制酒母、复合发酵等工序，酿造出酒精度达18%vol的酒醪，再加入石灰使其沉淀，经过压榨制得[1-2]。米麦曲酒结合了善酿酒与清酒的酿造工艺，在制作过程中，一部分大米蒸熟，冷却后添加生麦芽和米曲霉制成米麦曲[3-4]；一部分大米预先通过精磨去掉糠皮和糊粉层得到精米，达到70%的精米率，再经过蒸煮制酒[5-6]，将前两部分物料混合并添加适量的酵母和水制成酒母，将酒醪糖化发酵等后续工序制成米麦曲酒。

近年来，微量及痕量成分分析检测技术的发展，如乙醚萃取浓缩、顶空、固相微萃取等样品前处理技术及常用的检测仪器气相色谱-质谱（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）、气相色谱-火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、全二维气相质谱、毛细管电泳-电化学检测法等，推动了酿造酒的风味研究[7-10]。氨基酸是影响酿造酒感官评价的重要因素，尤其对酒体和口感影响较大[11]。在酒体方面，氨基酸的含量会影响酿造酒的色泽。一般来说，氨基酸的含量越高，酒体色泽越深，含量越低，则颜色越浅；在口感方面，氨基酸一般呈甜、鲜、酸、苦和涩的味道，其呈味特性使得其对酿造酒的口感有极大的影响，甚至中国黄酒与其他酒种的一大区别就是“氨基酸味”[12-13]。李妍等[14]采用高效液相色谱法测定黄酒中的氨基酸含量，并结合多元统计方法对黄酒的产地进行判别；孙军勇等[15]研究了氨基酸与黄酒中蛋白质浑浊的关系，发现谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸可能是造成蛋白质浑浊的主要原因；张楷正等[16]研究了传统咂酒中氨基酸含量的配比，对匝酒的氨基酸营养进行了评价；丁学利[17]研究了枸杞干果酒中氨基酸含量的变化，发现氨基酸在发酵过程中都是先升高后降低；田翔等[18]使用超高效液相色谱法，同时检测了黄酒中的17种氨基酸，该检测方法快速，准确且回收率高等[19]使用高效液相色谱检测葡萄酒和啤酒中的24种氨基酸；REDRUELLO B等[20]使用超高效液相色谱法，同时检测啤酒中的21种氨基酸。

米麦曲酒的香气是由酒中的各种风味物质提供的，而其口味又很大程度上受氨基酸的影响[21]，本研究采用气相色谱-质谱联用仪、氨基酸全自动分析仪结合感官评价对自制干型米麦曲酒的风味物质、氨基酸含量进行测定，尝试用多元线性回归方法，研究感官评价与米麦曲酒中风味物质、氨基酸含量之间的相关关系，以期对酒类风味与口感的关系，提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干型米麦曲酒（dry Mimaiqu rice wine，DMRW）（17.89±0.67）%vol：自制；黄酒（Chinese rice wine，CRW）（古越龙山金5年陈，14%vol）：四川省自贡市沃尔玛超市；清酒（Japanese sake，JNS）（獭祭50，16%vol）：日本购买；清酒酵母ACCC20045：实验室保存；安琪生香酵母：安琪酵母有限公司。

氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-辛醇（色谱纯）：百灵威科技有限公司；无水乙醇（色谱纯）、正己烷、乙醚、三氯甲烷（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；无水硫酸钠、三氯乙酸、浓盐酸（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

57330-U SPME手动进样手柄：美国Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：上海安谱实验科技股份有限公司；6790N-5975B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent科技有限公司；N-Evap氮吹仪：上海思伯明仪器设备有限公司；L-8900氨基酸全自动分析仪：日本HITACHI公司；CF15R高速离心机：日立集团；DHG-9123A电热干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米麦曲酒工艺流程及操作要点

大米的蒸煮：选择完整无残缺的糙米和精米，经过浸泡洗涤后自然沥干，于110 ℃蒸制45 min。糙米熟米饭和精米熟米饭的混合比例为3∶7。

米麦曲的制备：小麦在35 ℃培养24 h得到麦芽，将麦芽与熟米饭轧碎，按2.5∶6.0比例混合，同时加入小麦质量30%的水，拌匀，按原料质量0.7%接入麸皮种曲（菌种为米曲霉苏-16），35 ℃培养48 h，出曲。

米麦曲、酵母的添加：米麦曲的添加量在20%～25%；先将清酒酵母和安琪生香酵母活化，再在YPD液体培养基中纯培养24 h，达到107CFU/mL，然后两种酵母按原料质量的3%～8%与米麦曲混合。

酒母的制作：加入蒸饭和米麦曲之后添加一定比例的水，在56 ℃高温糖化5 h，然后加入0.7%乳酸酸化1 h，冷却后在无菌条件下加入酵母，密封后在生化培养箱中30 ℃培养24 h。

发酵时间：以CO2失重法判断米麦曲酒的发酵时间，以CO2失重为零作为发酵终点。

糖化发酵温度：借鉴日本清酒低温发酵技术，糖化发酵温度一般在10～20 ℃，发酵温度在15 ℃左右。

投料方式：选择多段式投料方法，避免一次性大量投料，否则由于酒母中的酵母增殖不够充分，使得杂菌有生长空间，降低酒的品质。按照经验，选择3段式投料方法，3段投料比例为1∶2∶4。

压滤：用滤袋或自动压榨机压滤。

澄清、过滤：在澄清罐中低温静置10 d，用过滤机添加一定量活性炭过滤。

煎酒：温度控制在85～90 ℃，时间控制在2～3 min。

老化：采用10 ℃低温冷藏半年到一年，即得米麦曲酒。

1.3.2 感官评价[12]

米麦曲酒感官评价在一个密闭无异味的房间中进行，采用编号盲评的方法进行，具体方法参考文献[12]，感官评价员由6位具有丰富经验的专业人士组成。感官评价分为香气评价（15分，其中醇香、清香和果香分别占5分）和口味评价（15分，其中清爽、柔和和醇厚分别占5分）。评分标准根据各项目的品评结果由弱到强为1～5分，取6位品评员的平均值为最终结果。

1.3.3 挥发性风味物质和氨基酸的定量分析

（1）挥发性风味物质GC-MS分析

GC条件：AgilentHP-5MS毛细管色谱柱（30.0m×0.2mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；分流比50∶1；程序升温条件：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至120 ℃，再以8 ℃/min升至230 ℃保持6 min；载气：99.999%氦气（He），载气流速：1 mL/min。

MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度为280 ℃，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围为30～550 amu，溶剂延迟2 min。

定性定量方法：样品中未知挥发性成分通过工作站美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11标准谱库自动检索，导出样品检索报告后筛选匹配，保留匹配度＞80的物质。使用内标法对米麦曲酒中风味物质含量进行半定量，内标物为色谱级2-辛醇（质量浓度为10 mg/100 mL），以内标物峰面积与各个风味物质峰面积的比值来确定风味物质的含量。

根据各个物质的阈值，确定米麦曲酒中各个风味物质的气味活度值（odor activity value，OAV）＞1的风味物质作为米麦曲酒的主要风味物质[22]。

（2）氨基酸分析

供试酒样中的游离氨基酸采用氨基酸全自动分析仪[23]，即53 min短程序（包括洗柱和冲柱时间）。酒样预处理：酒样过滤后，每10 mL加入40 mL的10%三氯乙酸除去蛋白质，使用高速离心机5 000 r/min离心10 min，取上层清液在电热干燥箱中50 ℃反复烘干3次去除醇类物质，然后用0.02 mol/L的HCl溶液定容至10 mL，离心后取1 mL上清液直接上机检测。

1.3.4 数据处理

采用SPSS 20.0、Graphpad Prism 8.0进行多元线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 干型米麦曲酒感官评价结果

2.1.1 香气评分

对干型米麦曲酒的3种香气评价醇香、清香和果香进行打分，结果见表1。根据李博斌等[24]的方法，将3种香气评价平方根之后加和（在数据处理上，使用平方根加和的原因是更利于回归分析），从而得到一个总的香气评分。

表1 米麦曲酒香气评价结果Table 1 Results of aroma evaluation of Mimaiqu rice wine

2.1.2 口感评分

根据李博斌等[12]的方法略作修改，对3种口味评价清爽、柔和和果香进行评分，结果见表2。

表2 米麦曲酒口感评价结果Table 2 Results of taste evaluation of Mimaiqu rice wine

2.2 三种酒样中挥发性风味物质测定结果

由表3可知，DMRW中OAV＞1的物质有7种，分别是正己酸乙酯（118.14）、辛酸乙酯（763）、乙酸异戊酯（129.67）、乙酸苯乙酯（19.1）、苯乙醇（1.1）、苯乙醛（2.04）和壬醛（9.33），这些物质对米麦曲酒的风味贡献较大。其中苯乙醛（0.051 mg/L）和壬醛（0.140 mg/L）的含量虽然较低，但由于它们的阈值很低，在低浓度下也具有较强的呈香作用，因此也是米麦曲酒的主要风味物质；而某些含量较高的物质，如乙酸乙酯（5.030 mg/L）和异戊醇（10.907 mg/L）等，由于香气阈值较高，在高浓度下才具有呈香作用，因此不是米麦曲酒的主要风味物质。JNS和CRW中OAV＞1的风味物质分别为7种和6种，JNS的主要风味物质有正己酸乙酯（481.5）、辛酸乙酯（1103）、癸酸乙酯（8.54）、丁酸乙酯（6.55）、乙酸异戊酯（18.93）、己酸（2.39）和辛酸（1.1）；CRW的主要风味物质分别是正己酸乙酯（38.29）、辛酸乙酯（376.2）、癸酸乙酯（4.165）、蘑菇醇（19）、苯甲醛（1.82）和苯乙醛（1.88）。

表3 三种酒样的挥发性风味物质含量、气味描述及气味活度值Table 3 Contents of volatile flavor compounds,odor description and odor activity values of 3 rice wine samples

续表

2.3 三种酒样中游离氨基酸的测定结果

由表4可知，3个酒样中共检出游离氨基酸（free amino acid，FAA）17种，包含6种必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和11种非必需氨基酸（non-essentialaminoacid，NEAA）。3个酒样中总氨基酸（total amino acid，TAA）含量最高的是CRW，达到了281.44 mg/100 mL，DMRW的TAA为147.41 mg/100mL，最低的是JNS，含量为91.65 mg/100 mL。CRW中含量最高的氨基酸是Pro，其次是Ala和Asp；JNS中Arg含量最高，其次是Ala和Asp；DMRW中Pro含量最高，Ala和Asp次之。DMRW使用的酒曲中含有一定量的小麦，且大米的精米率为70%，蛋白质损失较少，因此TAA高于JNS，但低于CRW。EAA/TAA比值最高的是SMRW，最低的是JNS；EAA/NEAA比值最高的是SMRW，超过50%，其余3种酒样均较低。

表4 三种酒样中氨基酸含量测定结果Table 4 Determination results of amino acid contents in 3 rice wine samples

2.4 多元线性回归分析结果

2.4.1 香气评分与挥发性风味物质含量的回归分析

将酒样中OAV＞1的风味物质作为研究对象，共21种风味物质。将这21种物质的含量与香气评价的平方根进行多元线性回归分析，结果见表5和图1。

由表5和图1可知，线性回归分析的结果中，挥发性风味成分含量与“醇香”的相关性较高，其总相关系数R2达到0.857，拟合度较好。通过相关系数R2可以发现，乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇、蘑菇醇和苯甲醛与“醇香”呈正相关，其显著水平达到了显著相关；正己酸乙酯与“醇香”呈显著的负相关。风味物质含量与“清香”和“果香”的相关性中等（R2接近0.8或R2＜0.8），其回归的相关系数R2分别为0.811和0.760，拟合一般，其中辛酸乙酯和己酸与“清香”呈现显著的正相关（P＜0.05），而异丁醇与“清香”呈现极显著的负相关（P＜0.01），蘑菇醇与“清香”呈现显著的负相关（P＜0.05）；风味物质中的正己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸与“果香”呈显著的正相关（P＜0.05），异丁醇与“果香”呈现极显著的负相关（P＜0.01），异戊醇、蘑菇醇和苯甲醛与“果香”呈现显著的负相关（P＜0.05）。传统意义上认为的酿造酒主要香气物质乙酸乙酯，并没有在“清香”和“果香”中呈现显著性关系，并且其相关系数为负，这一点与李博斌[12]的研究是相符合的，而正己酸乙酯在“清香”和“果香”中均表现出显著的正相关（P＜0.05），这一点与TAKAHASHI K等[25]的研究相符合。通过整个酒样的香气评分值与风味物质含量的回归模型可以看出，其相关系数R2为0.747，表明拟合度较低，说明挥发性风味物质含量与酒样的总体香气感官评价的相关性不高。其中，与香气评价有显著相关关系的物质是辛酸乙酯、异丁醇和蘑菇醇，辛酸乙酯与香气评价呈现显著的正相关（P＜0.05），蘑菇醇与香气评价分别呈现极显著的负相关（P＜0.01），异丁醇与香气评价呈现显著的负相关（P＜0.05）。乙酸乙酯的含量与总香气评分不具有显著的相关性（P＞0.05），且其相关系数R2为负数，无法对酿造酒的香气评价体现积极的作用。

图1 挥发性风味物质与香气评价的相关性Fig.1 Correlation between volatile flavor substances and aroma evaluation

表5 挥发性风味物质与香气评价的回归分析结果Table 5 Results of regression analysis for volatile flavor compounds and aroma evaluation

2.4.2 口感评分与氨基酸含量的回归分析结果

将酒样中的17种氨基酸含量与口味的感官评价作多元线性回归分析，结果见表6和图2。

由表6和图2可知，酒的感官评价中，“清爽”的评分值与氨基酸的含量的线性拟合一般，其相关系数R2为0.805，单个氨基酸中，“清爽”与各氨基酸的含量均呈现负相关，其中Val、Met、Lle、Leu、Lys、Asp、Gly、Ala、His和Pro与“清爽”呈现显著的负相关（P＜0.05），这可能是因为氨基酸的含量过高，会使得酒味更加醇厚，反而失去了清爽的口感。其中Lys、Leu和Lle的相关系数R2最高，分别为-0.913、-0.908和-0.907，而这三种氨基酸都是苦味氨基酸，酿造酒中“清爽”受这些氨基酸的影响较大。“柔和”与氨基酸含量的回归模型相关系数R2为0.549，拟合程度低，说明氨基酸含量与酿造酒口感中的“柔和”相关关系不强。从单个氨基酸来看，Glu和Arg与“柔和”有着显著的相关关系，它们的相关系数R2分别为0.745和0.783。氨基酸含量与“醇厚”的回归拟合十分良好，其相关系数R2为0.937，说明氨基酸含量的高低显著影响酿造酒浓醇的口感。几乎所有的氨基酸都与“醇厚”的评分有显著的正相关（P＜0.05），这说明氨基酸的甜、鲜、苦和涩味对口感中“醇厚”的评分都有正向的影响，鲜味和甜味越重，口感越醇厚，而苦味和涩味更加能丰富酿造酒的口感，使得酿造酒更加醇厚。从口感的总评分与氨基酸含量的回归关系来看，口感评分与氨基酸含量的线性拟合较低，相关系数R2为0.667，其中与口感评分呈显著相关关系的氨基酸是鲜味氨基酸Thr和Glu，甜味氨基酸Ser，既呈苦味又呈鲜味的Phe，这些氨基酸与口感评分都呈现正相关，而其他氨基酸与口感评分呈现负相关的氨基酸均不存在显著性（P＞0.05）。因此，虽然总感官评分与氨基酸含量的相关性较低，但是从单个氨基酸来看，某些氨基酸如Thr、Glu、Ser和Phe含量的增高，对酿造酒的口感还是具有显著的提升（P＜0.05）。

表6 氨基酸与口味感官的回归分析结果Table 6 Results of regression analysis for amino acids and taste sensory

图2 氨基酸与口感评价的相关性Fig.2 Correlation between amino acids and taste evaluation

3 结论

本研究对挥发性风味物质含量、氨基酸含量与感官评价中的香气评价、口感评价进行了分析，并采用多元线性回归分析。结果表明，挥发性风味物质含量与总香气评价相关性不强（R2=0.747）、与“醇香”相关性较强（R2=0.857），其中辛酸乙酯与香气评价呈现显著的正相关（P＜0.05），而异丁醇与香气评价呈现极显著的负相关（P＜0.01）。氨基酸含量与总口感评价相关性不强（相关系数R2=0.667）、与“醇厚”有显著的正相关（R2=0.937）（P＜0.05）、与单“清爽”有较强的负相关（R2=0.805），其中苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）和苯丙氨酸（Phe）与口感评分均呈现显著的正相关（P＜0.05）。

米麦曲酒中的风味物质含量十分丰富，多种化合物柔和交织，形成了复杂的香气和口感。研究各种风味物质包括氨基酸与米麦曲酒感官评价之间的相关性，对米麦曲酒的研究提供一定的理论依据。