LINC00242与胰腺癌发生发展及预后的相关性分析

成天琼，陈学农

(1.重庆市合川区人民医院，重庆 合川 401520；2.遵义医科大学附属医院 针灸科，贵州 遵义 563099)

胰腺癌(Pancreatic cancer)是常见消化系统肿瘤，预后较差，5年生存率不到5%，预计到2040年全球胰腺癌的发病率和死亡率将增长近80%[1]。胰腺癌的治疗选择有限，只有10%到20%的患者可以接受辅助化疗的根治性切除，且手术后的复发率很高[2]。胰腺癌缺乏早期诊断标志物，预后差，是临床研究的一大难点。

全基因组RNA测序表明，人类基因组中只有一小部分被转录为编码蛋白质的mRNA，其余部分为许多类型的非编码RNA(ncRNA)。既往研究者认为其余非蛋白质编码的转录是无功能的，非编码RNA也因此被视为垃圾RNA[3]。但越来越多的证据表明，ncRNA具有多种功能及生物学活性，调节基因表达和疾病发生、发展，如肿瘤生长、侵袭、迁移、转移和血管生成[4]。在ncRNA中，长链非编码RNA(lncRNA)和增强子RNA(eRNA)是最丰富的。ncRNA在胰腺癌发生发展中也起着关键作用，如LncRNALINC01963在胰腺癌组织和细胞系中表达较低，通过上调lncRNALINC01963在胰腺癌细胞系中的表达，可抑制集落数、细胞周期、增殖和侵袭，同时改善细胞凋亡，从而抑制胰腺癌的进展[5]。LncRNAZFAS1通过RHOA / ROCK2途径促进胰腺癌转移[6]。胰腺癌中异常表达了许多lncRNA和eRNA，而对于eRNA而言，它们在胰腺癌进展中的功能和机制在很大程度上尚不清楚。故本研究用集成数据分析方法来识别胰腺腺癌(Pancreatic Adenocarcinoma，PAAD)中的关键eRNA，并探讨其在胰腺癌预后、发生发展中的作用。

1 数据与方法

1.1 通过集成数据分析鉴定PAAD中的预后相关eRNA 首先从UCSCxena(https://xenabrowser.net/datapages/)下载33种癌症转录组数据及临床数据、生存数据，用EnsemblBioMart将Ensembl ID转换成基因Symbol。从既往的研究中获取由PreSTIGE预测的组织特异性增强子表达的lncRNA及其相应靶标的列表[7-8]。使用交互式网络服务器TANRIC(癌症非编码RNA地图集)研究TCGA中PAAD队列中上述列表中eRNA的表达水平及其临床相关性[9]。提取PAAD样品中eRNA的表达量并与生存数据合并。按照eRNA表达量将胰腺癌患者分为高低表达两组，Kaplan-Meier 生存分析比较两组间总体生存(Overall Survival，OS；Log-Rank检验，P<0.005)。然后研究TANRIC共表达数据，以评估eRNA与其预测的靶基因之间的相关性。用Spearman相关性分析上述生存相关eRNA与其靶基因在胰腺癌中的相关性，过滤标准为corFilter>0.4，P<0.001，用“ggplot2”R包作图。与总生存期(P<0.05)和其靶基因水平(P<0.001)均具有显著相关性的eRNA是PAAD中的候选关键eRNA。选取P值最小的生存相关eRNA后续进一步分析。然后用“limma”包分析在不同临床分组的胰腺癌样品中关键eRNA表达是否有差异。

1.2 GO、KEGG富集分析 为了研究关键eRNA相关编码基因的可能功能特性，共表达分析得到关键eRNA在胰腺癌中更多的潜在靶基因。使“clusterProfiler”R包进行对潜在靶基因行GO、KEGG富集分析(校正后P<0.05)，探讨关键eRNA在胰腺癌发生发展中的作用。

1.3 泛癌生存及相关性验证 从33种肿瘤中提取胰腺癌关键预后相关eRNA和其靶基因的表达量，与生存数据合并，按照eRNA表达量将癌症患者分为高低表达两组，Kaplan-Meier生存分析比较两组间生存差异。验证胰腺癌关键预后相关eRNA和其靶基因在泛癌中是否具有相关性。

2 结果

2.1 PAAD中预后相关eRNA及与其靶基因相关性分析 从TCGA中PAAD队列中RNA测序数据提取胰腺癌eRNA表达，按中位数分成高低表达两组，Kaplan-Meier生存分析结果提示147个eRNA表达水平和胰腺癌总体生存率相关(Kaplan-Meier对数检验，P<0.05)。再进一步对147种eRNA的水平与其预测的目标基因mRNA的水平作相关性分析，结果提示56对eRNA存在显著相关(见表1；Spearman相关系数r>0.4，P<0.001)。选取PAAD中预后相关最显著(P<0.000)的eRNA LINC00242进一步分析。

表1 与PAAD预后相关的eRNA及其靶标

续表

2.2 LINC00242可能是PAAD中的关键eRNA 在PAAD患者中，LINC00242高表达组比低表达组显示出较好的总体生存率(图1A，Kaplan-Meier对数秩检验，P<0.001)。此外，LINC00242和PHF10 mRNA水平成正相关(图1B，Spearman的r=0.412，P<0.001)。

2.3 LINC00242与临床病理特征相关分析 进一步分析LINC00242与患者的临床病理特征包括生存状态、肿瘤分级、肿瘤分期和肿瘤状态，详细信息见表2。结果显示，胰腺癌组织中LINC00242表达量低于癌旁组织(见图2A)，并且LINC00242的表达在胰腺癌组织不同分化等级(见图2B)、临床分期(见图2C)以及患者的最终结局状态(见图2D)方面均存在着明显的统计学差异。

表2 PAAD病例临床特征

2.4 GO、KEGG富集分析 LINC00242共表达分析显示在PAAD中1 846个基因和LINC00242具有相关性(r>0.4，P<0.001)，是LINC00242在胰腺癌中潜在靶基因。对以上潜在靶基因行基因本体论(Gene Ontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，探讨LINC00242在胰腺癌发生发展中的作用机制。GO富集分析结果分别显示了细胞成分(Cellular component，CC )、生物学过程(Biological process， BP)、分子功能( Molecular function，MF )前10个最显著的条目(见图3A，校正后P<0.05)，基因富集在化学突触传递调节、突触信号转导的调控等生物过程。为进一步验证LINC00242通过以上生物过程影响PAAD的发生发展，分析富集最显著的GO条目中基因与LINC00242的相关性，结果表明所有富集的基因与LINC00242皆有较高的关联(见表3，r>0.4)。KEGG通路富集分析表明LINC00242主要通过PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、cGMP-PKG信号通路、胰岛素分泌、cAMP信号通路等影响胰腺癌的发生(见图3B，校正后P<0.05)。

A：LINC00242在不同肿瘤状态的差异表达；B：肿瘤分级；C：肿瘤分期；D:生存状态。图2 LINC00242与临床病理特征相关分析

表3 最显著GO条目中富集基因与LINC00242的相关性

A：BP、CC、MF前10个最显著的GO条目；B：前30条显著富集通路。图3 潜在靶基因GO、KEGG富集分析

2.5 泛癌预后及相关性验证 泛癌生存分析表明eRNA LINC00242与肾上腺皮质癌(Adrenocortical carcinoma，ACC)、肾透明细胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、PAAD的预后相关(P<0.05)，其中LINC00242低表达与ACC(见图4A)、KIRC(见图4B)良好预后相关。LINC00242和PHF10共表达分析表明在睾丸生殖细胞瘤(Testicular germ cell tumors，TGCT；见图5A)、子宫癌肉瘤(Uterine carcinosarcoma，UCS；见图5B)、肝细胞癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC；见图5C)、葡萄膜黑色素瘤(Uvealmelanoma，UVM；见图5D)和PAAD 5种癌症中具有显著相关性(r>0.4，P<0.001)。

A：肾上腺皮质癌(ACC)；B：肾透明细胞癌(KIRC)。图4 LINC00242与泛癌生存分析

A：LINC00242和PHF10在睾丸生殖细胞瘤(TGCT)；B：子宫癌肉瘤(UCS)；C：肝细胞癌(LIHC)；D：葡萄膜黑色素瘤(UVM)4种癌症中呈正相关(r> 0.4，P<0.001)。图5 泛癌验证LINC00242和PHF10相关性

3 讨论

增强子是一类具有组织特异性的DNA调控元件,可通过与靶基因启动子相互作用来增强靶基因转录。活化的增强子可转录生成一类长链非编码RNA又称作增强子RNA。eRNA是在基因增强子区域衍生的lncRNA的特定亚类，能够顺式作用以影响相应基因的转录。在人类癌症中，致癌基因或致癌信号通路的激活通常由于增强子的激活和eRNA的产生引起[10]。为了增进对PAAD中eRNA的了解，本研究鉴定了PAAD中与预后相关的eRNA。最后结果显示LINC00242是PAAD中最显著的预后相关eRNA(P<0.000)，PHF10是其靶点。LINC00242在胰腺癌组织中的表达低于癌旁组织，且在胰腺癌组织不同分化、临床分期、患者最终结局状态等表达差异均有统计学意义(P<0.05)。LINC00242和PHF10的表达成正相关，在泛癌验证中显示LINC00242在ACC、KIRC、PAAD中与总体生存显著相关。表明LINC00242在胰腺癌预后及发生发展中具有一定的作用，为在以eRNA为靶标的胰腺癌治疗中的临床应用提供参考。

鉴定除其预测的靶基因PHF10外的其他共表达基因来阐明LINC00242的作用。除了PHF10，本研究还发现在胰腺癌中一共有1 846个与LINC00242的表达具有显著相关性的基因，这些基因是LINC00242在胰腺癌中的潜在靶基因。尽管eRNA功能主要在顺式中执行，但一些观察结果表明eRNA可以介导反式中其他基因的表达[11-12]，因此可以推测LINC00242具有直接或间接反式作用。尽管如此，转录本之间的相关性并不一定暗示因果关系，LINC00242是否是增强子活性的功能性成分仍有待确定。但是，根据基因本体论富集分析，与LINC00242相关的基因转录本主要参与突触信号转导过程，通过PI3K-Akt信号通路、有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路、cGMP-PKG信号通路、胰岛素分泌、cAMP信号通路等通路影响胰腺癌的发生发展。

PI3K-Akt信号通路参与多种癌症的发生发展[13-14]，胰腺星状细胞衍生的外泌体通过激活PI3K -Akt通路来促进胰腺癌细胞的增殖[15]。胰腺癌最常见的信号畸变发生在Wnt / Notch信号传导途径中，以及在表皮生长因子受体(EGFR)途径及其相关配体，EGF和转化生长因子-β中。血浆珠蛋白是EGFR信号通路的组成部分，在正常细胞粘附中起重要作用，且与肿瘤微环境中PI3K / AKT和MAPK信号通路的差异上调有关，表明它可能在胰腺癌发生中起重要作用[16]。一种新型circRNA(circNFIB1，hsa_circ_0086375)通过抑制PI3K / Akt途径抑制胰腺癌的淋巴管生成和淋巴转移[17]。KRAS突变发生在所有人类癌症的1/4中，有研究表明MAPK途径的各个成分有潜力作为治疗KRAS突变型癌症的靶标[18]。以上都表明PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路在胰腺癌中也起重要作用，这与KEGG富集结果相符合[19]。

总之，本研究应用了一种集成数据分析方法来识别PAAD中的关键eRNA。结果表明，LINC00242可能是PAAD的预后相关基因，其高表达在PAAD中预后良好，可以用作PAAD的组织特异性eRNA，LINC00242的潜在靶标是PHF10。随着研究的不断深入,LINC00242有望成为新型胰腺癌诊断、预后标志物以及潜在的治疗靶点。