孕激素通过FOXO1对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

刘维华，钟燕燕，郑 洪

(遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命健康。据最新数据显示，2018年，全球新确诊出29.5万多例卵巢癌患者，超过18万名女性因该病死亡[1]。尽管手术切除联合铂类化疗的治疗方案取得了一定的治疗效果，但由于该病早期症状不明显，多数患者确诊时已为伴有转移晚期，总体治愈率仍然很低[2]。因此，探究影响卵巢癌细胞发生发展的作用机制是有必要的。

卵巢是孕激素的主要靶器官，流行病学调查结果显示[3]，口服避孕药、妊娠(尤其多胎妊娠)及哺乳等可起到预防卵巢癌的作用。这些均表明孕激素对卵巢具有保护作用。FOXO1属于叉头框(Forkhead box,FOX)转录因子O亚家族的成员之一，是磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-rugulatedkinasea,ERK)等信号通路的共同下游分子[4]。而在肿瘤中，由于RAS、张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)或PI3K等上游基因的突变，这些信号通路经常处于异常激活状态，均可使FOXO1发生磷酸化而失活，促进肿瘤进展[5]。FOXO1在人类多种肿瘤如肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌、骨肉瘤等中表达降低，激活其表达可抑制肿瘤生长，因此被认为是一种重要的肿瘤抑制因子[6-9]。Diep等[10]研究表明，孕激素可通过孕激素受体B(Progesterone Receptor-B,PR-B)靶向FOXO1，诱导细胞周期抑制基因p21的表达，使细胞周期停滞于G0期，促进卵巢癌细胞衰老。这提示在卵巢癌中，孕激素可通过FOXO1对卵巢癌起到抑制作用。

Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤进展密切相关，在包括卵巢癌等许多实体肿瘤中均存在该通路的异常激活，其激活标志信号为β-catenin表达的明显升高[11]。Wnt/β-catenin信号通路在维持细胞干性和与PI3K/AKT通路的串扰中起着关键作用[12]。因此，本实验拟使用FOXO1抑制剂AS1842856抑制FOXO1的表达活性，在体外通过单独或联合应用孕激素和AS1842856检测其对卵巢癌HO-8910细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并结合Western blot检测FOXO1和β-catenin的蛋白表达情况，探索孕激素在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用机制是否与调节FOXO1-β-catenin有关，以期为卵巢癌的激素治疗和靶向治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人高级别浆液性卵巢癌HO-8910细胞株，购于江苏齐氏生物科技有限公司。BI胎牛血清购于以色列Biological industries公司；孕激素购于美国Med Chem Express公司；FOXO1抑制剂AS1842856购于美国Selleck生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；Transwell小室购于美国Corning公司；Matrigel基质胶购于美国BD Biosciences公司；兔抗人FOXO1单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-catenin单克隆抗体购于英国abcam公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购于武汉三鹰Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清，1%双抗的RPMI-1640培养基，于恒温 37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养HO-8910细胞。实验均选用对数生长期的HO-8910细胞进行，每组实验重复3次。

1.2.2 CCK-8法分别检测不同浓度孕激素和AS对HO-8910细胞增殖的影响 为了明确孕激素和FOXO1抑制剂AS1842856(AS)对卵巢癌HO-8910细胞体外生长情况的影响，并分别选择一个适宜浓度进行后续单独或联合加药实验。本实验参照前期研究设定的孕激素浓度范围及相关参考文献，选用不同浓度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分别作用于卵巢癌HO-8910细胞24、48、72 h，检测其对细胞增殖活性的影响。收集制备HO-8910细胞悬液(5×104个/mL)，接种于96孔板中，100 μL/孔。待细胞贴壁后，加入含不同浓度孕激素和含不同浓度AS的完全培养基，分别以0 μmol/L的孕激素组和0 μmol/L的AS组为对照组，同时设置空白组，每组3个复孔。分别作用24、48、72 h后，加入100 μL/孔含10% CCK-8的检测试剂，培养箱中温育2～3 h，测定450 nm处的吸光度值(Optical density value，OD)。细胞存活率=(加药组OD值﹣空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.3 孕激素和AS单独或联合作用对各组HO-8910细胞的影响

1.2.3.1 实验分组 实验分4组：对照组(等量不含药物的完全培养基)、孕激素(10 μmol/L)组、AS(1 μmol/L)组、AS(1 μmol/L)+孕激素(10 μmol/L)组，作用48 h。

1.2.3.2 CCK-8法检测各组HO-8910细胞的增殖情况 除实验分组的药物作用浓度和作用时间不同外，其余步骤均同1.2.2。

1.2.3.3 Transwell实验检测各组HO-8910细胞的迁移和侵袭情况 细胞迁移实验：Transwell小室的下室分别加入600 μL/孔的含10%血清的各组含药培养基，上室加入100 μL/孔的不含血清的各组含药细胞悬液(5×105个/mL)，每组3个复孔，作用48 h。固定，染色，倒置显微镜观察拍照并随机选取5个视野计数。细胞侵袭实验：除用50 μL/孔的Matrigel基质胶包被膜上室面并水化外，其余步骤均与细胞迁移实验相同。

1.2.3.4 Western blot检测各组HO-8910细胞的FOXO1和β-catenin蛋白表达情况 分别收集各组药物作用48 h后的细胞，加入裂解液，冰上裂解40 min，离心取上清，BCA法蛋白定量。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，蛋白上样20 μg/孔，电泳，切胶，转膜，封闭，孵育一抗FOXO1(1∶1 000)、β-catenin(1∶7 500)、GAPDH(1∶1 000)，4℃过夜。次日，TBST充分洗膜。室温孵育二抗1.5 h，TBST充分洗膜。滴加ECL发光液，曝光显影。Image J软件分析图像。

2 结果

2.1 不同浓度的孕激素和AS分别对卵巢癌HO-8910细胞增殖的影响 不同浓度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分别作用于HO-8910细胞24、48、72 h后，同一作用时间不同浓度之间的细胞存活率比较，分别以0 μmol/L孕激素组和0 μmol/L AS组为对照组，同一浓度不同作用时间之间的细胞存活率比较均以0 h的细胞存活率为对照，设为100.00%。结果显示：(1)与对照组相比，除2.5 μmol/L孕激素作用24 h组无显著差异(P>0.05)外，其余各组均显示抑制作用(P<0.05)。孕激素浓度越高，作用时间越长，对细胞增殖的抑制作用越强。(2)与对照组相比，除4 μmol/L AS作用48 h，2 μmol/L AS作用72 h，4 μmol/L AS作用72 h时表现为抑制作用外，其余不同作用时间不同浓度的AS对HO-8910细胞均具有促进作用(P<0.05)，且在AS浓度为1 μmol/L时，促进作用最强。结合实验结果，10 μmol/L孕激素作用48 h可明显抑制HO-8910细胞的增殖，1 μmol/L AS作用48 h可明显促进细胞增殖。因此，采用10 μmol/L孕激素和1 μmol/L AS单独或联合作用48 h进行后续实验(见表1)。

表1 不同浓度的孕激素和AS分别对HO-8910细胞增殖的影响

2.2 孕激素和AS单独或联合作用对卵巢癌HO-8910细胞增殖的影响 与对照组相比，孕激素组细胞增殖活性减低(P<0.05)，AS组细胞增殖活性升高(P<0.05)，AS+孕激素组细胞增殖活性减低(P<0.05)。与孕激素组相比，AS+孕激素组细胞增殖活性升高(P<0.05)；与AS组相比，AS+孕激素组细胞增殖活性减低(P<0.05，见图1)。

*：该组与对照组比较，P<0.05；#：该组与孕激素组、AS组比较，P均<0.05。图1 各组HO-8910细胞的增殖情况

2.3 孕激素和AS单独或联合作用对卵巢癌HO-8910细胞迁移和侵袭的影响 将4组进行单因素方差分析，4组差异具有统计学意义，4组均数不完全相等(F=76.07,P<0.05),再进一步进行两两比较。与对照组相比，孕激素组细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05)，AS组细胞迁移和侵袭数量增多(P<0.05)，AS+孕激素组细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05)。与孕激素组相比，AS+孕激素组细胞迁移和侵袭数量增多(P<0.05)；与AS组相比，AS+孕激素组细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05,见图2～3)。

*：该组与对照组比较，P<0.05；#：该组与孕激素组、AS组比较，P均<0.05。图3 各组HO-8910细胞的迁移和侵袭细胞数量

2.4 孕激素和AS单独或联合作用对卵巢癌HO-8910细胞FOXO1和β-catenin蛋白表达的影响 与对照组相比，孕激素组FOXO1蛋白表达增多(P<0.05)，β-catenin蛋白表达减少(P<0.05)；AS组FOXO1蛋白表达减少(P<0.05)，β-catenin蛋白表达增多(P<0.05)；AS+孕激素组FOXO1蛋白表达减少(P<0.05)，β-catenin蛋白表达减少(P<0.05)。与孕激素组相比，AS+孕激素组的FOXO1蛋白表达减少(P<0.05)，β-catenin蛋白表达增多(P<0.05)。与AS组相比，AS+孕激素组的FOXO1蛋白表达无统计学差异(P>0.05)，β-catenin蛋白表达减少(P<0.05，见图4～5)。

图4 各组HO-8910细胞中FOXO1和β-catenin的蛋白表达情况

A： HO-8910细胞中FOXO1；B：β-catenin的蛋白相对表达量；*：该组与对照组相比，P<0.05；&：该组与孕激素组相比，P<0.05；#：该组与孕激素组、AS组相比，P均<0.05。图5 各组HO-8910细胞中FOXO1和β-catenin的蛋白相对表达量

3 讨论

本实验结果显示，孕激素浓度越高，作用时间越长，对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性的抑制作用越强。这与沈倩倩等[13]的孕激素能抑制卵巢癌细胞的增殖，促进细胞凋亡的研究结果相符。据文献报道[14-15]，FOXO1抑制剂AS在1 μmol/L时可显著抑制FOXO1的转录活性及蛋白表达。本研究结果显示，1 μmol/L AS作用48 h可明显抑制HO-8910细胞中FOXO1的蛋白表达，与之相符。综合实验结果及联合用药的需要，故后续实验拟用10 μmol/L孕激素及1 μmol/L AS单独或联合作用48 h检测其对HO-8910细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

本实验结果显示，10 μmol/L孕激素可以显著抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这与傅优等[16]研究结果相符。Jeon等[17]研究也显示孕激素在卵巢癌细胞中具有抗增殖和抗转移的作用，与本实验结果相符。本实验结果显示，用1 μmol/L AS抑制FOXO1后，卵巢癌HO-8910细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力均增强，这表明抑制FOXO1后可明显降低FOXO1的肿瘤抑制作用。Paik等[18]关于基因工程小鼠模型(GEMMs)的研究表明，FOXO1，FOXO3和FOXO4的所有6个等位基因完全丧失会显著诱导以胸腺淋巴瘤和血管瘤为特征的进行性癌症，同样说明FOXO1失活可消除其肿瘤抑制功能，与本实验研究结果相符。

本实验结果显示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910细胞后，FOXO1的蛋白表达上调，表明孕激素可能具有诱导FOXO1蛋白表达的作用。Yin等[19]研究表明，孕激素可通过与PRs结合，抑制PI3K/AKT信号通路，上调核FOXO1的表达，抑制子宫内膜异位症的发生发展，与本研究观点相符。与只加入10 μmol/L孕激素相比，当加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，FOXO1蛋白表达减少，卵巢癌HO-8910细胞的增殖、迁移和侵袭能力都相对增强。该结果表明，孕激素可能通过FOXO1对卵巢癌HO-8910细胞的增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用。与Diep等[10]的孕激素可通过PR-B靶向FOXO1，诱导卵巢癌细胞细胞周期阻滞，促进细胞衰老的研究结果相符。这提示在卵巢癌中，孕激素可通过FOXO1对卵巢癌起到抑制作用。与只加入1 μmol/L AS相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，FOXO1蛋白表达未见明显变化，卵巢癌HO-8910细胞的增殖、迁移和侵袭能力都相对减低，同时低于对照组，说明FOXO1抑制剂AS对FOXO1活性表达的抑制作用强于孕激素对FOXO1的诱导作用，同时孕激素可能还通过其他机制抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。例如，有研究表明，孕激素可通过调节PI3K/AKT途径增加nm23-H1表达并抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭[17]；孕激素可通过降低粘着斑激酶(FAK)和Src磷酸化，抑制卵巢癌细胞的迁移侵袭[20]等，可见孕激素抑制肿瘤发生发展机制复杂，多种机制参与了卵巢癌进展。

经典Wnt/β-catenin信号通路是与肿瘤转移密切相关的一条信号通路，在许多肿瘤中激活表达，β-catenin是该信号通路的关键调节分子[17]。本实验结果显示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910细胞后，β-catenin的蛋白表达下调，说明孕激素可能具有抑制β-catenin蛋白表达的作用。Nagendra等[21]的研究表明孕激素可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制小鼠模型中浆液性卵巢癌细胞的生长，这与本研究结果相符。本实验结果显示，加入1 μmol/L AS后，β-catenin蛋白表达上调，表明在卵巢癌HO-8910细胞中抑制FOXO1可上调β-catenin的蛋白表达。Ling等[12]的研究发现，FOXO1过表达可抑制CCND1的表达抑制胰腺癌PDAC细胞周期从G0/G1到S的转变，而CCND1是Wnt/β-catenin信号转导的靶标，并表明FOXO1的下调导致Wnt/β-catenin信号通路活性增强，促进PDAC细胞增殖和上皮-间质转化(EMT)。Lin等[22]的研究显示，MiR-5188可直接靶向降低FOXO1的蛋白表达水平诱导β-catenin的激活，介导肿瘤干细胞的增殖，转移，化学耐药和c-Jun信号转导。Zhang等[23]的研究结果表明，MiR-27a可通过靶向FOXO1活化Wnt/β-catenin信号通路促进卵巢癌细胞的EMT，均与本研究结果相符。与只加入1 μmol/L AS组相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表达量减少，说明孕激素还可能通过其它机制抑制卵巢癌HO-8910细胞β-catenin的蛋白表达。例如，Feng等[24]研究显示，孕激素可通过调节H19和miR-152的表达来调节Wnt/β-catenin信号传导途径来改善子宫内膜息肉症。与只加入10 μmol/L孕激素相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表达量增多，说明抑制FOXO1后，孕激素对β-catenin蛋白表达的抑制作用减弱，孕激素可能通过上调FOXO1抑制β-catenin的蛋白表达。Wang 等[25]研究表明，孕激素可通过诱导DKK1和FOXO1的表达，抑制Wnt/β-catenin信号传导，从而起到维持子宫内膜稳态，抑制子宫内膜癌进展的作用，与本研究结果相似。

综上所述，本实验结果表明，孕激素对卵巢癌HO-8910细胞的增殖、迁移和侵袭均具有抑制作用，该作用可能是孕激素通过促进FOXO1进而抑制β-catenin的蛋白表达实现的。然而，本实验在一株细胞系中进行，结果相对较单一，仍需进一步增加细胞系或动物实验来验证实验结果。同时孕激素受体有PR-A、PR-B、PGRMC1、PGRMC2等类型，它们在孕激素对卵巢癌细胞发挥作用中的作用及其机制如何仍有待探索，以更好地为卵巢癌发生发展的机制研究和临床治疗提供理论基础。