ICS Ⅱ通过上调PGC-1α和MCAD蛋白的表达改善SHR左心室重构

丁瑞雪，林小英，董 兰，李光月，伍红瑜，杨丹莉

(遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，药学院，贵州 遵义 563099)

高血压心脏病是原发性高血压的主要并发症之一。左心室重构(心肌肥大、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等)是高血压心脏病形成的关键病理基础[1-2]。而心肌能量代谢紊乱可加速左心室重构发生发展。过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α，PGC-1α)是调节细胞能量代谢的重要因子，能促进脂肪酸β-氧化，并改善心室重构[3-4]。除通过降血压外，上调心肌PGC-1α蛋白的表达，促进脂肪酸β-氧化，亦是改善高血压心脏病的重要策略。自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)是研究高血压心脏病的理想动物模型[5]。淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ，ICS Ⅱ)是小檗科植物淫羊藿主要成分之一。课题组前期研究发现ICS Ⅱ具有降低SHR血压、改善左心功能等作用[6]。而目前鲜有研究报道ICS Ⅱ对SHR心肌PGC-1α和脂肪酸β-氧化的影响。因此，本课题拟研究ICS Ⅱ是否通过上调PGC-1α，促进脂肪酸β-氧化，继而干预SHR左心室重构。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 淫羊藿次苷Ⅱ(纯度≥98%，批号：FY 17460602，江苏省南京泽朗医药科技有限公司)；高效RIPA裂解液(货号：R0010，Solarbio公司)BCA法蛋白定量试剂盒(货号：GK5012，Generay Biotech公司)；鼠单克隆PGC-1α抗体(货号：66369-1-Ig，Proteintech公司)；兔多克隆CPT-1α抗体(货号：15184-1-AP，Proteintech公司)；兔多克隆MCAD抗体(货号：55210-1-AP，Proteintech公司)；兔多克隆GAPDH抗体(货号：10494-1-AP，Proteintech公司)；Goat Anti-Rabbit IgG HRP(货号：S0001，Affinity公司)。

1.2 仪器 Eppendorf 5417R台式低温离心机(德国Eppendorf公司)；MultisKan全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；SUPPLY电泳系统(美国BIO-RAD公司)；Trans-Blot SD半干转印槽(美国BIO-RAD公司)；CCD成像系统(美国BIO-RAD公司)；BX43正置研究级显微镜(日本Olympus公司)；EG1150石蜡包埋机(德国Leica Biosystems公司)。

1.3 实验动物及分组 14只13周龄雄性SHR及7只同龄雄性WKY，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，均为无特定病原体(Specific pathogen-free，SPF)级，许可证号：SCXK(京)2016-0006。21只大鼠于SPF级动物房适应性喂养1周，将14只SHR随机分为模型组(SHR组)、ICS Ⅱ 8 mg/kg剂量组(ICS Ⅱ组)，以7只WKY作为空白对照组(WKY组)。ICS Ⅱ组灌胃ICS Ⅱ混悬液，WKY、SHR组给予等体积双蒸水，每日1次，持续12周。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠心脏质量指数的测定 给药结束后称大鼠体重(g)，腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)，打开胸腔取出大鼠心脏，用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，滤纸吸干称量大鼠全心重(mg)，计算心脏质量指数(全心重/体重)。

1.4.2 H&E染色 取大鼠左心室组织于10%中性甲醛溶液固定48 h后，将组织放入石蜡包埋盒进行梯度乙醇脱水完成石蜡包埋，切片，展片，常规脱蜡后进行H&E染色，使用BX 43正置研究级显微镜观察大鼠左心室病理变化。

1.4.3 Western Blot检测大鼠左心室组织中PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白水平 称取大鼠左心室组织100 mg，剪碎，加入1mL裂解液(PMSF溶液：RIPA裂解液=1∶100)，用匀浆机进行匀浆，冰上裂解30 min，离心15 min(4 ℃、12 000 rpm)，用BCA法测定上清液蛋白总含量。配制10 %SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，8%脱脂牛奶室温封闭2.5 h，TBST洗膜，4℃孵育一抗过夜(18 h)：PGC-1α(1∶5 000)、CPT-1α(1∶2 000)、MCAD(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)，室温孵育二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜，High-sigECL显色，CCD成像系统采集图像并用Image Lab测量蛋白灰度值。

2 结果

2.1 ICS Ⅱ对SHR心脏质量指数的影响 与WKY组相比，SHR组心脏质量指数升高了16.2 %(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ组心脏质量指数下降了9.6 %(P<0.05，见图1)。

2.2 ICS Ⅱ对SHR左心室形态学的影响 H&E染色发现，WKY组左心室无明显病理损伤，心肌细胞排列整齐；SHR组左心室心肌细胞肥大、排列紊乱、炎性细胞浸润；ICS Ⅱ组左心室心肌细胞排列趋于整齐、炎性细胞浸润减轻、心肌细胞肥大明显改善(见图2)。

#：P<0.05 vs the WKY; *：P<0.05 vs the 图1 ICS Ⅱ对SHR心脏质量指数的影响

A:WKY;B:SHR;C:ICS Ⅱ。图2 SHR左心室H&E染色(400×)

2.3 ICS Ⅱ对SHR左心室组织PGC-1α蛋白表达的影响 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室PGC-1α蛋白表达降低了15.8%(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ组大鼠左心室PGC-1α蛋白表达升高了28.0%(P<0.05，见图3)。

#：P<0.05 vs the WKY；*：P<0.05 vs the 图3 ICS Ⅱ对SHR左心室PGC-1α蛋白表达的影响

2.4 ICS Ⅱ对SHR左心室组织CPT-1α蛋白表达的影响 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室CPT-1α蛋白表达降低了25.9 %(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ组大鼠左心室CPT-1α蛋白表达升高了44.1 %(P<0.05，见图4)。

#：P<0.05 vs the WKY; *：P<0.05 vs the 图4 ICS Ⅱ对SHR左心室CPT-1α蛋白表达的影响

2.5 ICS Ⅱ对SHR左心室组织MCAD蛋白表达的影响 与WKY组相比，SHR组大鼠左心室MCAD蛋白表达降低了51.0 %(P<0.05)；与SHR组相比，ICS Ⅱ组大鼠左心室MCAD蛋白表达升高了100.5 %(P<0.05，见图5)。

#：P<0.05 vs the WKY；*：P<0.05 vs the SHR 图5 ICS Ⅱ对SHR左心室MCAD蛋白表达的影响

3 讨论

左心室重构是心脏对压力容量超负荷的一种适应性反应，是心力衰竭和猝死等心血管事件发生的危险因素。因此，尽早防治和改善左心室重构对于治疗心血管疾病具有重要意义。SHR与人类高血压的发病机制相似，并可引发高血压心脏病。SHR 4～6周龄血压开始升高，8周龄出现左心室代偿性重构，20周龄发生失代偿心室重构[7-8]。因此本研究选用26周龄SHR制备左心室重构模型。WKY大鼠常作为SHR的正常对照组。本研究结果显示，与WKY组相比，SHR组心脏质量指数升高，左心室心肌细胞肥大、排列紊乱、炎性细胞浸润，确证SHR 26周龄时出现左心室病理重构。

ICS Ⅱ是淫羊藿重要活性成分，具有抗炎、抗衰老、抗氧化等药理作用。课题组前期研究发现ICS Ⅱ具有改善SHR心肌细胞凋亡、心肌肥大等心室重构作用[6,9]；超声检查中发现ICS Ⅱ抑制26周龄SHR大鼠左心室舒张末期内径和后壁舒张末期厚度等指标增加[6]。本研究结果显示，ICS Ⅱ可以降低SHR心脏质量指数，改善SHR左心室心肌肥大、炎性浸润等病理变化，确证ICS Ⅱ具有改善SHR左心室重构的作用。

心肌在泵血过程中需要消耗大量能量。高血压心脏病病理发展中伴随着心肌细胞能量代谢紊乱和左心室重构，改善心肌能量代谢能抑制其左心室重构。PPARα/γ是PPARs家族的成员[10]。激活PPARα/γ可以调控脂肪酸氧化基因表达，促进心肌对脂肪酸利用。Cheng等[10]发现在异丙肾上腺素诱导的小鼠心室重构模型中，PPARγ和PGC-1α蛋白表达均下调。Kulikova等[11]发现在阿霉素诱导的小鼠扩张型心肌病模型中，PPARα和PGC-1α表达降低，而PPARα激动剂Wy14643能增加PPARα和PGC-1α表达，改善心肌能量代谢，减轻阿霉素诱导的心肌损伤。课题组前期研究发现，ICS Ⅱ通过上调左心室PPARα/γ表达，改善SHR心肌肥大等左心室重构[9]。PPARs与PGC-1α是心肌能量代谢的重要调节因子。PGC-1α可与PPARα/γ相互作用，调节心肌能量代谢[3]。

PGC-1α是心肌能量代谢的关键调控因子，其家族有PGC-1α、PGC-1β、PGC-1相关激活剂(PGC-1-related coactivator，PRC)3个成员[4]。研究表明，PGC-1α基因敲除的小鼠心肌能量代谢受损，心肌收缩力下降[12]；此外，抑制PGC-1α表达可引起脂质代谢关键基因表达下调[13]。PGC-1α激活后可以上调肉毒碱酰基转移酶1α(Carnitinepalmitoyltransterase-1α，CPT-1α)和中链酰基辅酶A脱氢酶(Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)的表达，改善脂肪酸β-氧化[14]。CPT家族是由不同基因编码的4种不同亚型组成：肝脏亚型(CPT1α或L-CPT1)，肌肉亚型(CPT1β或M-CPT1)，大脑亚型(CPT1γ)和CPT2。3种CPT1亚型的组织分布各不相同，其中CPT1α主要分布于肝、肠、心脏等组织中，位于线粒体外膜上，是脂肪酸代谢限速酶，可催化脂肪酸转运至线粒体内进行β-氧化[15-16]。MCAD是酰基辅酶A脱氢酶家族成员之一，位于线粒体中，催化线粒体中脂肪酰基辅酶A酯的β-氧化的第一个脱氢步骤，是脂肪酸β-氧化的关键限速酶，可直接反映脂肪酸β-氧化程度，MCAD表达升高，脂肪酸β-氧化增强[17]。本研究结果显示，与WKY组相比，SHR组大鼠左心室PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白表达下调；给予ICS Ⅱ后，SHR左心室PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白表达上调，提示ICS Ⅱ可上调SHR的PGC-1α表达，促进心肌脂肪酸β-氧化。

综上所述，ICS Ⅱ至少可能通过上调PGC-1α、促进心肌脂肪酸β-氧化，而改善SHR左心室重构。