RIP1/RIP3-MLKL 信号通路与慢性心力衰竭的发生、发展及预后相关

陈永锋，李小荣，赖薇薇，朱飞宇，谭 鑫，鲜 维，康品方，王洪巨

蚌埠医学院1第一附属医院心血管科，2心脑血管病基础与临床重点实验室，3医学影像学院2017 级1 班，安徽蚌埠233000

慢性心力衰竭（HF）是一种全球性疾病，目前世界HF人数大约增加到2300万人，并且近一半的患者是射血分数降低的心衰，其5年生存率为25%［1］。冠心病、糖尿病、心脏瓣膜病和心律失常等［2］心血管疾病可引起HF，因其在临床症状上表现相对隐匿，其发现和诊断存在一定挑战性。HF的发病机制多种多样，目前研究较为明确的包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）的激活、心肌重构、顺应性低下、交感神经兴奋性增强等，此外，现越来越多的证据表明程序性坏死亦参与心血管疾病［3,4］。

有研究发现，RIP1/RIP3-MLKL信号途径在小鼠HF模型中表达上调，并用抑制剂或基因敲除技术阻断该通路能使HF功能改善［5-7］。目前对该信号通路的研究在人HF疾病中尚未有明确报道，RIP1/RIP3-MLKL信号通路在HF患者中是否有同样的表达需进一步研究。因此本研究探索RIP1/RIP3-MLKL通路与HF的分级以及治疗之间的关系，为慢性HF的发病机制和防治方法提供实验依据，为逆转慢性HF患者的心功能提供治疗新靶点。

1 资料和方法

1.1 材料试剂

酶标仪（BioTokinstrumentsIns）；RIP1 抗体、RIP3抗体、MLKL抗体和β-actin抗体（abcam）；ELISA检测试剂盒：HumanRIP1、RIP3、MLKL（上海羽朵）；显影仪（VIVILBER）。

1.2 研究对象

本研究为前瞻性分析性研究，入选2020年2月～2020年10月在我院接受治疗的慢性HF患者（NYHAⅡ～Ⅳ级）。选择同期本院21例健康对照者（对照组）。慢性HF患者纳入标准：根据2017年美国心脏病学会（ACC）联合美国心脏协会（AHA）发布的HF治疗和诊断指南［8］，分组如下：对照组（n=21）、Ⅱ级组（n=20）、Ⅲ级组（n=33）、Ⅳ级组（n=43）。排除标准：合并有急性心肌梗死、心肌病、瓣膜病、先天性心脏病等严重原发心脏疾患以及合并有急性感染、严重原发代谢性疾病、风湿免疫相关性疾病或怀疑有恶性消耗性疾病等其他严重疾患的患者被排除在本研究之外。纳入者年龄在31～92岁，样本的使用经本院（蚌埠医学院第一附属医院）伦理委员会批准，并取得所有受试者的知情同意。

1.3 样本准备

标本准备：通宵禁食后的早上采集所有患者的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h内以2000 r/min离心10 min，取离心后的上层血浆，血浆置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 ELISA法检测对照组和慢性HF患者血浆中RIP1、RIP3、MLKL水平

使用HumanRIP1、RIP3、MLKL 检测试剂盒，按ELISA厂家检测说明，测定人血浆RIP1、RIP3、MLKL表达水平。

1.5 Western blot检测RIP1/RIP3-MLKL信号通路在对照组和慢性HF患者机体表达情况

使用已分装好的血浆，加入RIPA 后冰上裂解30 min，4 ℃离心机中15 000 r/min离心30 min，提取血浆总蛋白，根据BCA蛋白定量法说明书测各组蛋白浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95 ℃变性5 min，每组取40 μg蛋白，配置10%SDS-PAGE凝胶，根据计算所得体积上样后电泳（60 V，30 min待marker出现条带分离后，调整为120 V，90 min待15 000相对分子质量到达胶下缘是停止电泳）；转膜（200 mA，2 h）至PVDF膜上；5%BSA液室温封闭2 h（或4 ℃过夜）；一抗室温孵育4 h（或4 ℃过夜），内参选用β-actin［9］；TBST洗涤3次，10 min/次；二抗室温孵育2 h；TBST洗涤3次，10 min/次；ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统获取图像。

1.6 临床随访

本课题组对心功能Ⅳ级患者进行为期5个月的随访，通过住院、门诊或电话途径，对比患者预后指标LVEF、LVEDD、NT-ProBNP表达情况。

1.7 统计学方法

采用单因素方差分析、SNK、Tamhane's T2检验（实验结果用均数±标准差，数据使用SPSS 22.0软件进行分析，以P<0.05表示差异有统计学意义）。ImageJ8.0软件分析Western blot条带灰度值，Graphpad-prism8.3.0进行统计学分析。Spearman法分析RIP1/RIP3-MLKL的表达量与HF 相关性，pearson 法分析RIP1、RIP3、MLKL与Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相关性，独立样本t检验检测患者预后指标LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的差异性。

2 结果

2.1 患者一般情况

在对照组、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四组中，各组间年龄、GLU、TG和LDL差异无统计学意义（P>0.05），WBC、HDL、AST、ALT、Scr差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

表1 各组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data among the groups

2.2 受试者血浆中RIP1、RIP3和MLKL的含量

在本研究中慢性HF 患者年龄与RIP1、RIP3/MLKL的表达量无相关性（P>0.05）。ELISA检测结果显示，与正常组相比，心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加（PⅡRIP3=0.002，PⅡRIP1=0.001，余P<0.001）；与Ⅱ级组相比，心功能Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加（PⅢRIP1=0.001，余P<0.001）；与Ⅲ级组相比，心功能Ⅳ级组RIP1、MLKL表达量增加（P<0.001、P=0.044，表2）。

表2 人血浆中RIP1、RIP3和MLKL的表达水平Tab.2 Comparison of plasma levels of RIP1,RIP3 and MLKL among the 4 groups

2.3 受试者血浆中RIP1、RIP3和MLKL Western blot 检测结果

Western blot检测结果显示，与正常组比较，心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加（PⅣRIP1=0.003PⅡRIP3=0.009，PⅢRIP3=0.001，PⅣRIP3=0.003，PⅣMLKL=0.003，余P<0.001）；与Ⅱ级组相比，心功能Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL 表达量增加（PⅣRIP1=0.006，PⅢRIP3=0.004，PⅣMLKL=0.006，余P<0.001）；与Ⅲ级组相比，心功能Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量增加（PⅣRIP1=0.04，PⅣRIP3=0.002，PⅣMLKL=0.007，表3）。

2.4 RIP1、RIP3和MLKL与HF的相关性分析

运用Spearman 相关分析，慢性HF 患者RIP1、RIP3、MLKL的表达量与心功能分级均呈正相关（P≤0.001，表3）。

表3 RIP1、RIP3、MLKL与心功能分级的相关分析Tab.3 Correlation analysis of RIP1,RIP3 and MLKL with cardiac function grades

2.5 RIP1、RIP3和MLKL与Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相关性分析

经pearson统计方法进行相关性分析后，HF患者的RIP1/RIP3-MLKL与Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相关，与LVEF呈负相关（表4）。

表4 RIP1、RIP3和MLKL与Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相关性分析Tab.4 Correlation of RIP1,RIP3 and MLKL levels with Scr,AST,LVEF,LVEDD and NT-ProBNP

2.6 临床随访

本课题组对以上心功能Ⅳ级患者进行为期5个月的随访，共随访43人，失访10人，有效例数33人，在心功能Ⅳ级的33例患者中，按照RIP1/RIP3-MLKL的总表达量以中位数为界值将患者分为低高2组（分别对应A组16例，B组16例），对比两组患者预后指标：LVEF、LVEDD、NT-ProBNP表达情况。随访前对比A/B两组患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD指标无差异性（P>0.05），随访后A/B两组患者NT-ProBNP、LVEF指标有统计学差异（P<0.05），LVEDD表达无差异（P>0.05，表5，6）。

表5 随访前A/B两组患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD表达情况Tab.5 Expression of NT-proBNP,LVEF and LVEDD in patients with grade IV cardiac function with low(group A)and high RIP1/RIP3-MLKL expressions(group B)before follow-up

3 讨论

HF是诸多心血管疾患发展到后期的临床终末事件［10-12］，HF的发病机制与心室重构、心肌细胞凋亡、增殖和心脏炎症因子表达增加有关［13-16］。最新研究发现：程序性坏死RIP1/RIP3-MLKL信号通路已证实在大鼠HF模型中表达增加，而抑制该通路的激活和表达明显改善HF大鼠心功能［5-7］。因此，研究HF患者血浆中RIP1/RIP3-MLKL标志物水平变化，以及相关标志物与HF患者预后关系，对于寻找治疗HF心室重构的药物提供了新方向。

图1 Western blot检测RIP1/RIP3-MLKL通路蛋白表达Fig.1 Western blotting of protein expressions in the RIP1/RIP3/MLKL pathway (n=3).Compared-with.normal-group;##P<0.01,###P<0.001 vs control;**P<0.01,***P<0.001 vs grade II,△P<0.05,△△P<0.01 vs grade III.

程序性坏死，也称坏死性凋亡，主要由受体相互作用的蛋白激酶RIP1、RIP3和混合谱系激酶结构域样蛋白MLKL介导。当程序性坏死被诱导激活时，MLKL LVEDD:Left ventricular end-diastolic dimension;NT-ProBNP:Recombinant N-Terminal probrain Natriuretic Peptide;LVEF:Left ventricular ejection fraction.信号因子被RIP3磷酸化并寡聚，然后蛋白易位至细胞质膜以执行程序性坏死［17］。而RIP1/RIP3作为程序性坏死中的关键信号分子，其形成的复合体启动下游信号MLKL转导并发生自磷酸化触发坏死性凋亡［18-21］。现研究已证实，RIP1/RIP3-MLKL信号通路在动物及人类多种疾病中有表达，在调节各种生理过程中起关键作用［22-27］。因此本研究探讨该信号通路在HF患者中的表达情况，我们发现与正常组相比，Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组外周血RIP1、RIP3、MLKL浓度含量均增加，而与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ组测值浓度均有升高，在Ⅲ组和Ⅳ组比较中，RIP3因子表达浓度含量虽有上调，但差异无显著性，提示在Ⅲ级以上该因子可能存在稳定的高水平表达，而RIP1和MLKL表达升高差异有显著性，WB中各蛋白表达量与上述趋势符合。此外结合Spearman相关分析，健康对照者及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级HF 患者的心功能等级与RIP1/RIP3、MLKL 的表达趋势呈正相关，提示RIP1/RIP3-MLKL表达增加促进HF疾病的发生发展。Zhou等发现在大鼠HF模型中心肌组织RIP1/RIP3-MLKL表达与HF疾病程度呈正相关［23,28］，本研究在外周血中得到同样的结果。因此，抑制该通路的表达可能是慢性HF的新治疗策略。

表6 随访后A/B两组患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD表达情况Tab.6 Expression of NT-proBNP,LVEF and LVEDD in patients in groups A and B after follow-up

随着研究的深入，对于疾病的预后认知越发全面，Chan等研究者发现肌酐、NT-ProBNP、转氨酶等指标是心衰预后不佳的重要危险因素［29］。本研究pearson相关分析提示HF患者的RIP1/RIP3-MLKL表达量与Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相关，与LVEF呈负相关。为此，根据RIP1/RIP3-MLKL水平评估HF患者临床预后尚未有定论。本研究针对心功能Ⅳ级患者进行为期5 个月的临床随访，发现随访前A/B 两组患者LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的指标无差异，而5个月后随访结果提示两组患者LVEF、NT-ProBNP指标有显著性差异，LVEDD改变虽无统计学意义，但B较A组有上升趋势，而在心功能Ⅳ级随访的患者中，有5人死亡全因心源性，其中2人属于A组，3人属于B组，表明RIP1/RIP3-MLKL 表达量高的B 组预后更差，提示RIP1/RIP3-MLKL表达量可能与HF预后有关。

综上所述，RIP1-RIP3-MLKL信号通路在HF患者中表达明显增加，与HF严重程度呈正相关。临床随访发现慢性HF的发生、发展及预后可能与程序性坏死通路RIP1/RIP3-MLKL的激活与表达有关，这为临床HF的诊断治疗提供新的思路和见解。