瑶医九龙十八症汤对胃溃疡热证大鼠胃黏膜损伤及相关因子的影响*

包富龙 邓晶晶 闫国跃，2 王文博 曾诗睿 李 梅 李 彤，2△

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西壮瑶医药与医养结合人才小高地，广西 南宁 530001）

九龙十八症汤是广西民间治疗胃溃疡、急慢性胃炎、胃痛的经验方，由九龙盘、十八症、田皂角、山菠萝、白狗肠、一点红、香附、陈皮、厚朴、野荞麦、佛手组成。本方临床运用效果较为理想，收录于《瑶医临床验方集》［1］。本课题组通过构建大鼠胃溃疡热证模型，探讨九龙十八症汤治疗胃溃疡热证的机制，为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量280～320 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司［许可证号：SCXK（湘）2019-0014］。饲养温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%，保持室内光照明暗各12 h。适应性喂养7 d后用于实验。本研究涉及的动物实验符合实验动物伦理学要求。

1.2 药物与试剂 九龙十八症汤组方药物购买于南宁市水街药材市场，经广西中医药研究院中药资源所黄云峰副研究员鉴定。水提取物稠膏的制备：取组方10剂药量按1∶10的比例加蒸馏水，浸泡30 min后，武火加热煮沸后文火微沸1 h，倒出所得汤剂，药渣同法煎煮2次，合并滤液，水浴浓缩成稠膏状提取物，生药质量浓度为3.2 g/g，放于4℃冰箱保存，使用时用蒸馏水配制到相应浓度。干姜水煎剂的制备：干姜500 g加蒸馏水2 000 mL，武火加热煮沸后微沸煎煮，浓缩至500 mL，即生药质量浓度为1 g/mL，储存于4℃冰箱备用。冰醋酸（广东光华科技股份有限公司，批号：20170812）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号：141115）；左金丸（湖北香连药业有限责任公司生产，国药准字 Z42020884）。6-keto-PGF1α、血栓素 B2（TXB2）、白细胞介素-8（IL-8）ELISA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器 1510酶标仪，Thermo Fisher Scientific Oy美国赛默飞；TDL-5-A低速离心机，上海安亭科学仪器厂；DM18光学显微镜，德国徕卡公司；游标卡尺，中国上海三圈牌。

1.4 分组与造模 参考文献［2-4］，将60只大鼠随机分为空白组、模型组、左金丸组（阳性药组）、九龙十八症汤高剂量组（高剂量组）、九龙十八症汤中剂量组（中剂量组）、九龙十八症汤低剂量组（低剂量组），每组10只，雌雄各半。除空白组外，各组大鼠每日用干姜水煎液灌胃2次，每次5 mL/kg体质量，连续14 d，两次间隔时间4 h。于造模第11天起，每日第1次干姜水灌胃后禁食不禁水，第2次干姜水灌胃后4 h给予15%醋酸1 mL灌胃1次，恢复进食。连续4 d。空白组予等量的蒸馏水灌胃。模型组死亡1只，其余组大鼠全部存活。模型的验证：造模结束后从各组大鼠中随机抽1只，禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉后处死摘取整个胃组织，肉眼观察胃黏膜溃疡情况，剪胃溃疡部位制作HE染色切片后进行光学显微镜下检查。大鼠胃溃疡热证模型的评定指标如下。1）体征指标［5］：主症为口渴多饮、舌红，次症为消谷善饥、牙龈红肿、粪便干结、小便量少色黄、亢奋、鼻唇爪趾耳郭发红。2）胃部解剖学和组织学检查［6-7］：胃黏膜可见明显火山口样溃疡，胃黏膜弥漫性充血，黏膜表面黏液细胞分泌减少，淋巴细胞浸润，胃主细胞减少。满足以上的评定标准，即可认为大鼠胃溃疡热证模型复制成功。

1.5 给药方法［8］造模成功后次日，各组给予相应药物灌胃，九龙十八症汤按体表面积法换算成大鼠的等效剂量，10.75 g/kg作为中剂量组，高剂量为21.50 g/kg，低剂量为5.37 g/kg，左金丸组为1 g/kg。空白组、模型组予等量蒸馏水灌胃，给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续7 d。

1.6 标本采集与检测 1）血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2检测。末次给药后，把各组大鼠转移至代谢笼，搜集粪便和尿液（24 h代谢量）。水合氯醛麻醉后开腹，主动脉采血约4～5 mL置于不加抗凝剂的试管内，室温静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液分装入1.5 mL EP管中，放置到-20℃冰箱中保存，用ELISA法检测免疫指标。2）黏膜病变和溃疡指标测定。采血后立即解剖大鼠，充分暴露胃体，肉眼观察腹腔及胃体病变情况，与周围组织或脏器粘连及粘连的程度，记录并拍照。观察各组大鼠胃壁损伤、胃黏膜充血情况，用游标卡尺测定溃疡中心，量取最大横径（d2）和纵径（d1），溃疡指数（S）［9］按以下公式计算：S=π·d1/2·d2/2（注：π取3.14）。溃疡抑制率=（模型组平均溃疡指数-给药组平均溃疡指数）/模型组平均溃疡指数×100%。3）胃黏膜病理组织HE染色。切取胃部置于预冷的PBS中漂洗干净表面血渍，吸干水分后剪取部分胃组织用10%多聚甲醛溶液固定24 h，行石蜡包埋，切片后进行HE染色。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量数据以（±s）表示，组间两两比较用单因素方差分析，方差齐用LSD法检验，方差不齐用Tamhane′s T2法检验。P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异具有极显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠胃组织肉眼观察情况 空白组：胃组织结构完整，黏膜呈淡红色，表面光滑，并覆盖有较多黏液，皱襞表面光滑，走向有规则，黏膜表面完整，无溃疡、水肿及充血等病理变化。模型组：胃窦、胃大弯黏膜糜烂可见多处出血灶，可见数量不等的圆形或椭圆形火山口样溃疡，呈中间凹陷，周围隆起状，且溃疡底部平坦覆盖有浅白色苔膜，边界清晰，周围黏膜水肿充血，无穿孔。阳性药物组溃疡灶易分辨，可见少量炎性渗出物，颜色较周围正常组织白，个别黏膜有轻微糜烂，出血灶肉眼观察明显比模型组小、少。九龙十八症汤高剂量组：胃黏膜可见轻微的糜烂，溃疡较平坦，局部黏膜缺损范围小于模型组，有个别愈合较好。九龙十八症汤中剂量组：溃疡愈合较好，大部分可以找到溃疡灶，面积较小，部分可见少量充血点及炎性渗出物，浸润深度最小，个别已愈合。九龙十八症汤低剂量组：胃黏膜有不同程度糜烂，溃疡灶明显，多数胃体仍可见出血灶，恢复情况是给药组中最差的。

2.2 各组大鼠胃组织HE染色观察 见图1，图2。空白组：黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层结构完整，形态规则。上皮细胞呈单层柱状细胞核小、圆形，未见核分裂。肌层细胞致密完好，浆膜层完整，未见炎细胞浸润和出血。模型组：可见溃疡处黏膜缺损，腺体消失，黏膜面表层见炎性渗出，其下可见坏死组织血管增生扩张充血形成肉芽组织，期间大量炎性细胞浸润，浆膜层较多炎性细胞渗出。阳性药组：胃黏膜恢复较完整，黏膜腺体重现，坏死组织已基本消失，间质充血、水肿基本消失，炎性细胞及渗岀物比模型组明显减少。九龙十八症汤高剂量组：多数胃黏膜结构恢复较好，坏死组织较少，较多炎性细胞浸润，黏膜面较多炎性及纤维素渗出。中剂量组：胃黏膜恢复好，坏死组织消失，个别已基本恢复，间质仅可见少量炎性细胞，血管轻度充血。低剂量组：胃黏膜有一定程度的修复，但在给药组中恢复程度最差，仍可见不少坏死组织和渗出物，可见炎细胞浸润。

图1 各组大鼠胃病理组织（HE染色，50倍）

图2 各组大鼠胃病理组织（HE染色，100倍）

2.3 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率比较 见表1。模型组与空白组比较溃疡指数有显著差异（P＜0.05）。各给药组溃疡指数与模型组比均有显著差异（P＜0.05）。中剂量组抑制率最高，且和阳性药组比有显著差异（P＜0.05）。高剂量组抑制率高于阳性药组但没有显著差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率比较（±s）

表1 各组大鼠溃疡指数及溃疡抑制率比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阳性药组比较，▲P＜0.05。下同。

组别空白组模型组阳性药组高剂量组中剂量组低剂量组n 9 8 9 9 9 9溃疡指数（mm2）0 8.84±0.78*5.06±0.79*#4.67±0.94*#3.21±0.69*#▲5.83±0.71*#溃疡抑制率（%）--42.79 47.19 63.66 33.99

2.4 各组大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α和TXB2水平比较 见表2。各组大鼠血清IL-8水平从高到低为模型组、低剂量组、阳性药组、高剂量组、中剂量组、空白组，与空白组比较，中剂量组IL-8没有显著差异，其余组均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，用药组均显著降低（P＜0.01）；与阳性药组比较，高、低剂量组没有显著差异（P＞0.05），中剂量组有显著差异（P＜0.05）。各组大鼠血清6-keto-PGF1α水平从高到低为空白组、中剂量组、高剂量组、阳性药组、低剂量组、模型组；与空白组比较，其余组含量均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，除了低剂量组，其余组均显著高于模型组（P＜0.01或P＜0.05）；与阳性药组比较，高剂量组、低剂量组没有显著差异（P＞0.05），中剂量组有显著差异（P＜0.01）。各组大鼠血清TXB2水平从高到低为模型组、低剂量组、阳性药组、高剂量组、中剂量组、空白组；与空白组比较，其余组TXB2含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组降低程度没有显著差异（P＞0.05），其余组均有显著性差异（P＜0.01）；与阳性药组比较，高剂量组没有显著差异（P＞0.05），中、低剂量组有显著差异（P＜0.01）。6-keto-PGF1α/TXB2的比值由高到低为空白组、中剂量组、高剂量组、阳性药组、低剂量组、模型组。

表2 各组大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比较（±s）

表2 各组大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比较（±s）

组别空白组模型组阳性药组高剂量组中剂量组低剂量组n 9 8 9 9 9 9 IL-8（pg/mL）289.79±17.42 387.24±24.48**333.65±18.00**##326.49±24.46**##304.94±35.79##▲347.18±17.36**##6-keto-PGF1α（pg/mL）360.62±13.64 245.31±9.97**267.58±20.17**#277.37±12.91**##295.94±25.65**##▲▲256.71±10.93**TXB2（pg/mL）208.40±12.66 344.94±21.76**269.54±11.28**##265.20±12.89**##233.73±17.12**##▲▲330.86±26.45**▲▲6-keto-PGF1α/TXB2 1.73 0.71 0.99 1.05 1.27 0.78

3 讨论

胃溃疡临床主要表现为中上腹周期性、节律性钝痛、腹胀、反酸、烧灼感［10］。胃溃疡病因有环境、饮食、免疫、感染和遗传等，通常是多种因素联合作用的结果［11］。胃溃疡的瑶医病名称作革施扪，属于瑶医的扭类病（即胃病症），扪证（即痛证）。瑶医认为本病是因为气候失常，人体感受寒邪、疫瘴邪气、痧气，外邪侵入人体经脉，壅阻于胃部，日久邪气盈盛，阻滞经脉，人体盈亏失衡，三元失谐，形成邪盈过盛的病理状态，经脉不通则痛；或饥饱失常、饮酒过量，导致胃脾功能受损，形成脾胃正亏过衰、邪盈过盛，人体盈亏失衡，三元失谐，日久成痨，不荣则痛［12］。治疗以祛邪为急，针对气滞、寒凝、湿热、血瘀等致病因素，祛除其主要“病邪”，以打药祛邪；正亏过衰以扶正为先，以风药扶正。胃溃疡热证属于瑶医里的邪盈过盛而正亏不衰症。九龙十八症汤在组方中以九龙盘、十八症、白狗肠、野荞麦为主药，都属于瑶药中的风打相兼药。九龙盘祛风除湿，理气止痛，止血散瘀；十八症祛风、散瘀止痛；白狗肠凉血、行瘀；野荞麦清热解毒、活血散瘀、消肿止痛。方中主药功效以清热解毒、活血散瘀为主，能清泄胃热，化胃络热久所生瘀血。以田皂角、厚朴、山菠萝、一点红、香附、佛手、陈皮为配药。田皂角清热解毒、止血、拔毒生肌；厚朴理气行滞、祛风镇痛；山菠萝清热解毒、行气止痛、止血生肌。此3味药属于瑶药中的风打相兼药。一点红清热解毒、止痛、活血散瘀；香附理气止痛、止血；陈皮理气化积；佛手理气，和胃止痛。此4味药属于瑶药中的风药。方中配药功效以理气止痛、止血生肌为主，还能辅助主药加强清热解毒、活血散瘀的功效。全方共奏清热解毒，理气止痛之功效，祛除中焦胃之热毒，使机体恢复三元和谐，盈亏平衡的状态。

胃溃疡的发病机制复杂，现有研究发现前列腺素能影响胃黏膜血流量且对胃肠黏膜的细胞起保护作用［13］。其中PGI2既可使胃黏液分泌增加，防止H+回渗，又能增加胃黏膜血流量，改善胃黏膜微循环灌注，起到保护胃黏膜的作用；而TXA2能使胃黏膜动脉强烈收缩、血小板聚集形成血栓，同时介导细胞及溶酶体膜的破坏，引发急性炎症应答，使中性粒细胞向炎症部位聚集，从而使胃黏膜缺血缺氧，细胞变性坏死，使H+外溢，造成出血和溃疡。健康人PGI2/TXA2保持一定的比例［14-15］。在胃溃疡炎症反应的传递过程中IL-8等促炎细胞因子发挥着至关重要的作用［16-17］。PGI2、TXA2生物半衰期极短，离体后很快转化为稳定的代谢物6-keto-PGF1α和TXB2，因此一般通过检测6-keto-PGF1α和TXB2来反映血清PGI2和TXA2的含量。

本研究发现九龙十八症汤能改善大鼠胃组织溃疡的情况，减轻胃窦、胃大弯黏膜糜烂的程度，修复出血灶，显著改善胃黏膜水肿充血的情况。各给药组溃疡面积和深度比模型组显著减小，溃疡指数与模型组比均有显著差异。光镜下观察各组胃组织的病理切片，九龙十八症汤各剂量组大鼠胃黏膜有不同程度的修复，黏膜腺体重现。黏膜面表层坏死组织减少，改善间质充血、水肿的情况，炎症细胞减少，浸润现象减轻。

各造模组大鼠血清IL-8水平均有所上升，除了中剂量组均显著高于空白组，说明本实验胃溃疡模型的形成和IL-8含量升高有关。在给药干预后，各给药组血清中IL-8含量均有所下降，九龙十八症汤各剂量组和模型组比均有显著差异，中、高剂量组均优于阳性药组，且中剂量组和阳性药组比有显著差异。各造模组大鼠血清6-keto-PGF1α水平均显著低于空白组，说明本实验胃溃疡模型的形成和PGI2含量降低有关。在给药干预后，各给药组血清6-keto-PGF1α含量均有所升高。九龙十八症汤高、中剂量组和模型组比有显著差异，中、高剂量组均优于阳性药组，且中剂量组和阳性药组比有显著差异。各造模组大鼠血清TXB2水平均显著高于空白组，说明本实验胃溃疡模型的形成和TXB2含量升高有关。在给药干预后，各给药组血清中TXB2含量均有所降低，九龙十八症汤高、中剂量组和模型组比有显著差异，中、高剂量组均低于阳性药组，且中剂量组和阳性药组比有显著差异。由各组大鼠血清6-keto-PGF1α/TXB2比值可知，各给药组的比值均有上升，中剂量组上升最快。实验结果提示，九龙十八症汤能降低大鼠血清中IL-8、TXB2的水平，升高6-keto-PGF1α水平，使6-keto-PGF1α/TXB2的比值水平趋于平衡，从而起到促进溃疡愈合，减少溃疡形成的作用。以上情况综合说明九龙十八症汤对大鼠胃溃疡（热证）模型具有较好的治疗效果，初步确定九龙十八症汤治疗胃溃疡热证的有效性。