罕见B(A)亚型的血清学特征及基因序列分析

陈静思，林甲进，张瑛，游维，江明华

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.输血科；2.医学检验中心

AB0血型系统是输血医学中最具重要临床意义的红细胞血型系统，血型的准确鉴定在临床输血、法医学、器官移植、亲子鉴定中具有重要作用。B(A)亚型是一种罕见的ABO表型，是B等位基因发生突变导致，在血清学表现上既有B抗原的特点，又有A抗原的特性，在血型鉴定时易误判为B型或AB型，给临床血型鉴定和临床输血造成一定的困难和安全风险[1-3]。鉴于其血清学特征的特殊性，近年来引起临床的广泛关注[4-5]。现将我们积累的8例B(A)型标本检测的血清学特征及基因测序结果总结报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2013年3月至2021年6月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院的8例ABO血型正反定型不一致或抗原减弱的血样，分别记为标本1～8，其中男2例，女6例，年龄7～69岁，均无血缘关系。入选标准依据《ABO亚型的检测》要求[6]，排除标准为标本红细胞与抗-A1凝集素反应阳性者。抽取外周静脉EDTA抗凝血5 mL待检。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 单克隆抗-A和抗-B、抗-A1凝集素、单克隆抗-H血型定型试剂（上海血液生物医药有限公司）；A、B、O细胞由本科室制备；聚凝胺试剂（武汉贝索有限公司）；基因组DNA试剂盒、人类红细胞ABO血型-B(A)基因分型试剂盒（天津秀鹏生物技术有限公司）。ID-Centrifuge-12S II型离心机；ID-Incubator-37SI型孵育器(瑞士达亚美有限公司)；PCR扩增仪；3730基因测序仪（美国ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 检测方法：采用单克隆抗-A、抗-B、抗-H、抗-A1凝集素、ABO标准红细胞采用试管凝集法进行血型检测；采用聚凝胺交叉配血法，将标本与A型、B型、AB型、O型供血者分别进行交叉配血，标明主次侧，主侧为患者标本血浆100 μL及供者2%～5%红细胞悬液50 μL，次侧为供血者血浆100 μL及2%～5%标本红细胞悬液；采用序列特异性引物-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction sequencespecific primer PCR-SSP）法进行基因分型；采用Sanger直接测序法进行基因测序。严格按照仪器试剂说明书及测序方法步骤。

1.3.2 ABO血型基因分型和测序：采用磁珠法提取DNA，用人类红细胞ABO血型/B(A)亚型基因分型试剂盒（PCR-SSP法），按照说明书操作；采用Sanger测序法将产物送至测序公司进行直接测序；使用chromespro软件及DNAMAN8.0软件将测序公司提供的abo序列与ABO基因参考序列（NG_006669.1）进行对比，根据dbRBC数据库以及ISBT数据库[Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023]确定基因型。

ABO基因分型、测序分析，在天津秀鹏生物技术有限公司协助下完成。

2 结果

2.1 血清学和基因型检测结果 8例标本红细胞与抗-A反应呈1+至2+，与抗-A1反应呈阴性，与抗-B反应呈3+至4+，与抗-H反应呈3+至4+，血清与Ac反应呈2+至4+，与Bc、Oc、自身细胞均不反应；8例样本经PCR-SSP法检测ABO基因分型为B(A)亚型。8例标本血清学和基因型检测结果见表1。

表1 8例标本血清学和基因型检测结果

2.2 基因测序 8例标本直接测序结果：标本1、3、4、5、7的第六外显子为c.261delG和c.297A＞G，第七外显子为c.526 C＞G、c.640A＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.930 G＞A杂 合；标本2、6、8的第六外显子为c.261delG和c.297A＞G，第七外显子为c.526 C＞G、c.657 C＞/T、 c.700 C＞G、c.703 G＞A、c.796 C＞A、c.803 G＞ C、c.930 G＞A杂合（见图1、图2、图3）。

图1 B(A)04、B(A)02基因序列主要碱基替换位点

图2 B(A)04基因测序c.640 A＞G杂合错义突变

图3 B(A)02基因测序c.700C＞G杂合错义突变

2.3 交叉配血 8例样本主侧与A型、AB型供血者红细胞悬液凝集反应阳性，与B型、O型供血者红细胞悬液凝集反应阴性；次侧与A型、B型、O型供血者血浆凝集反应阳性，与AB型供血者血浆凝集反应阴性。8例样本与A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血结果见表2。

表2 8例样本与A型、B型、AB型、O型供血者交叉配血结果

3 讨论

正常A型、B型、AB型等位基因分别位于第9号同源染色体的ABO位点上，从父亲或母亲遗传而来，但极少数人1条9号染色体上存在1个B(A)基因，其编码酶具有双功能活性，除催化A抗原、B抗原的合成，还具有表现出AB型的特征，称为B(A)血型。B(A)抗原形成机制还没有完全阐明，认为B(A)基因产物既能合成大量尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal、B抗原糖供体），又能合成少量尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺（UDP-GalNAC、A抗原糖供体）到H抗原表面，形成其主要特征。B(A)型的表现频率极低，国内献血人群、国外欧洲人群分别报道在1/5万～1/10万、1/17万～1/58万[7]，文献报道中国汉族B(A)型等位基因分布在北方和南方基本相似，B(A).04为1.6/10万人，B(A).02为0.78/10万人[8]。YAMAMOTO等[9]首先发现由遗传学上的B型红细胞表达弱的A抗原为特征的常染色体控制表型，具有顺式遗传方式。1993年，第1次发现了既能编码正常B糖基转移酶又具有A糖基转移酶活性的B等位基因，这个等位基因后被命名为B(A).01。目前已报道有7种B(A)等位基因，分别为B(A).01、B(A).02、B(A).03、B(A).04、B(A).05、B(A).06，B(A).07[10-11]。国内相关文献报道的B(A)亚型以个案报道和家系为主，等位基因有5种：B(A).02、B(A).04、B(A).05、B(A).06、B(A).07，以B(A).04、B(A).02多见[12-13]。本研究8例标本采用PCR-SSP法对其进行基因分型，确定其基因型B(A).04/O.01.02 2例、B(A).02/O.01.02 2例、B(A).04/O.01.01 2例、B(A).04/A.01.01 1例、B(A).02/O.01.01 1例，以B(A).04、B(A).02为主。

基因测序分析是鉴定疑难血型的重要手段。有研究报道[14]，B(A)亚型主要的血清学特点是其红细胞与抗-B呈现正常凝集强度、与高效价单克隆抗- A具有明显反应、与人源性抗-A或经过一定比例稀释的单克隆抗-A在室温中不反应、与单克隆抗-H反应凝集强度3～4+，反定型结果与正常B型反应结果一致。本研究8例样本的红细胞与单克隆抗-A呈低度凝集强度、与单克隆抗-B呈正常凝集强度、与抗-A1凝集素不反应、与单克隆抗-H反应强度接近O型，正定型结果表现为A弱B特征，呈现“A弱B强”，反定型结果表现为B型特征；其血清学检测结果与上述文献报道基本一致，至于B(A)亚型红细胞是否存在冷反应A抗原及其血清学异质性差异，有待于后续留取该类样本进行进一步检测探讨。目前B(A)基因突变有c.700 C＞G、c.640 A＞G和c.641T＞C，分别由YU等[15]于1999年、郭忠慧等[16-17]于2004年和2006年首先报道。本研究通过基因测序发现B(A).04与B101/O01序列比对，在640位核苷酸发生A＞G单碱基突变，导致第214位甲硫氨酸转变为缬氨酸；B(A).02与B101/O02序列比对，在700位核苷酸发生C＞G单碱基突变，导致第234位脯氨酸转变为丙氨酸，与上述报道一致。本研究中，将罕见的B(A)亚型血清学检测结果和基因序列分析相结合，为患者血型鉴定和后续临床输血提供安全保障。

目前针对B(A)亚型患者的临床用血尚无统一的评价标准，本研究通过交叉配血实验表明，B(A)型血型无论被鉴定是AB型还是B型，即输注AB型悬浮红细胞或B型的血浆均有产生严重溶血反应的可能；鉴于B(A)亚型发现的稀有特征，以致B(A)血型的供血者极少，在临床上难以满足同型输血，基本采用自体或相容性输注的原则，对B(A)型患者采用自体备血或输注洗涤B型、O型红细胞或输注AB型非红细胞血液制品。同时在临床输血前，当正定型和反定型出现不相符时，需要结合血型血清学、家系成员及采用分子生物学技术方法来正确鉴定和判定血型，避免漏检ABO亚型，确保后续临床安全输血。