氧化锌和二氧化钛纳米颗粒对淡水绿藻的单一及联合毒性研究

2021-11-09王壮金世光张帆王德高

农业环境科学学报 2021年10期

王壮，金世光，张帆，王德高

（1.南京信息工程大学环境科学与工程学院，南京 210044；2.大连海事大学环境科学与工程学院，辽宁大连 116026）

伴随着纳米科技的快速发展，各种工程纳米结构材料正被广泛应用于各行各业[1−2]。值得关注的是，纳米技术已逐渐渗透到农业生产链条的各环节，其中纳米科技与农业结合最密切的领域是纳米农业化学品，如纳米型杀虫剂[3]、纳米肥料[4]。随着现有纳米材料市场渗透的日益增加和不间断的新纳米材料的开发，大量的工程纳米颗粒（ENPs）将不可避免地释放到大气[5]、水[6]、土壤[7]中，成为潜在的环境污染物[8]。化学污染物通常以各种混合形式存在于环境中[9−10]，因此在靠近或远离点源处，ENPs 可能会以混合物的形式暴露于自然生态系统中。据报道，多元ENPs 混合物和各单一ENPs 均表现出截然不同的生态毒性[11−14]。因此，阐明多元混合ENPs 对生态物种的联合毒性作用及机制，将有利于为ENPs 在自然环境中的生态效应提供更为全面的评估。

多元ENPs对生态物种的联合毒性作用方式主要表现为拮抗作用[15−16]、协同作用[17−18]及加和作用[11，19]。不同化学成分的ENPs所组成的混合物对同一物种表现出的毒性效应也明显不同。如CuO NPs 与CuNPs对发光细菌——费氏弧菌（Vibrio fischeri）的联合毒性表现为拮抗作用，而CuO NPs 与Zn NPs 对费氏弧菌的联合毒性表现为协同作用[11]；类似地，CeO2NPs 与TiO2NPs 组成的二元混合物对氨氧化模式菌株——欧洲亚硝化毛杆菌（Nitrosomonas europaea）的毒性作用为拮抗作用，而CeO2NPs 与ZnO NPs 组成的二元混合物对该细菌的毒性作用为协同作用[20]。此外，具有相同成分的ENPs混合物对不同物种也会呈现出不同的毒性效应。例如Cu NPs 与ZnO NPs 对虹鳟鱼（Rainbow trout）的联合毒性为协同作用[21]，而该二元混合体系对费氏弧菌[10]和生菜（Lactuca sativaL.）[22]的联合毒性作用方式为拮抗。因此，混合组分类型和受试生物类型均是影响多元ENPs联合毒性的重要因素。

ENPs对生态物种的毒性效应会随着作用时间的变化而发生变化[23−24]。这意味着不同暴露时间可能会影响多元ENPs对生态物种的联合毒性及其作用方式。然而，有关不同暴露时间对多元ENPs 联合毒性及其作用方式的影响研究仍是空白。同时，目前的研究通常只评估单一剂量/浓度下多元ENPs 的联合毒性作用方式，却很少有研究从全剂量/浓度的角度评价多元ENPs的联合毒性作用方式。本研究选取两种广泛应用且具有代表性的金属氧化物ENPs（即ZnO NPs[25]和TiO2NPs[26]）为研究对象，通过毒性测试，考察在不同暴露时间和全浓度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分别对两种淡水绿藻[斜生栅藻（Scenedes⁃mus obliquus）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）]的单一和联合毒性；利用毒性单位法（毒理学中用来定量研究混合物中毒物相互作用的常用方法），评估在不同暴露时间和全浓度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分别对斜生栅藻和蛋白核小球藻的联合毒性作用方式；应用经典混合毒理方法，预测在不同暴露时间和全浓度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分别对斜生栅藻和蛋白核小球藻的联合毒性。

1 材料与方法

1.1 实验材料及测试介质

ZnO NPs 和TiO2NPs 粉体购自德国PlasmaChem公司。ZnO NPs 的纯度>99%，原始粒径约为14 nm，比表面积为（30±5）m2·g−1；TiO2NPs 为金红石相/锐钛矿相混合物，纯度>99.5%，原始粒径为（21±5）nm，比表面积为（50±10）m2·g−1。将测试材料的粉体分散于高纯水中以制备储备液，随即将储备液在可控温度下超声处理30 min 备用。本研究选取ZnCl2中的Zn2+作为ZnO NPs 溶解释放的Zn2+的毒性参考物质，ZnCl2（纯度>99.99%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。两种淡水绿藻（斜生栅藻和蛋白核小球藻）的原种购自中国科学院武汉水生生物研究所。荧光探针2′，7′−二氯荧光素酶（DCFH−DA）购自上海麦克林生化科技有限公司。

实验所用的测试介质参考国际经济合作与发展组织（OECD）制定的藻类生长抑制实验准则配制（附表1，扫描文章首页OSID 码浏览）[27]。在磁力搅拌器的搅拌下，将ENPs 储备液加入测试介质中以制备其测试组悬浮液。

1.2 物理化学性质表征

使用透射电子显微镜对ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物在测试介质中的形貌进行表征（TEM，JOEL 2100f，JOEL 有限公司，日本东京）。使用马尔文激光粒度仪（ZetaSizer Nano ZS90，Malvern Instru⁃ments Ltd.，Worcester−shire，英国）对 ZnO NPs 和 TiO2NPs 及其二元混合物在测试介质中的零点电势和水动力学直径进行表征，考虑到该仪器的检出限，本测试选取悬浮颗粒浓度为10 mg·L−1。基于经典DL⁃VO理论[28]，通过计算颗粒间相互作用的总势能确定测试介质中ZnO NPs和TiO2NPs及其二元混合物的悬浮稳定性。使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP−MS，Thermo Fisher iCAP−Q，德国）确定ZnO NPs 溶解部分的浓度。

1.3 藻类生长抑制实验

实验期间，取一定量对数生长期的斜生栅藻和蛋白核小球藻重新悬浮于新鲜的OECD 培养基中，培养至藻细胞密度分别为3×105个·mL−1和4×105个·mL−1。淡水绿藻的培养和毒性测试条件为温度（24±1）℃，光暗周期比12 h∶12 h，将培养基静置于人工气候箱中，每日摇动3 次以保证绿藻处于悬浮状态且使得ENPs 与藻细胞均衡接触。选取 24、48、72、96 h 的生长抑制率作为斜生栅藻的毒性终点，选取24、48、72 h的生长抑制率作为蛋白核小球藻的毒性终点。

1.4 藻细胞氧化损伤检测

藻细胞内的活性氧（ROS）含量通过荧光探针法测定。ROS测定过程如下：取对数生长期的藻液分别暴露于ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物中30 min，并设立对照组（未染毒纳米颗粒的藻液）。为突出这两种ENPs 对ROS 生成的显著性诱导，选取中高效应浓度10 mg·L−1为主要研究浓度。将暴露于各测试组后的藻液在15 000 r·min−1下离心10 min，弃去上清液，加入DCFH−DA 荧光探针，使其浓度为10µmol·L−1。25 ℃下黑暗避光孵育 30 min，然后用OECD 培养基清洗藻细胞以去除松散结合的颗粒物，使用荧光分光光度计（F96PRO，上海棱光技术有限公司）检测各测试组的荧光信号。

1.5 评估和预测联合毒性

应用对数模型（公式1）构建ZnO NPs 和TiO2NPs及其二元混合物的浓度−反应曲线（CRCs）。通过CRCs 得到每个处理组的效应值（E）。本研究选取单一ENPs 的毒性终点时的均值效应浓度（EC50）值作为混合比率对ZnO NPs和TiO2NPs进行二元混合。

式中：C为颗粒物浓度，mg·L−1；θ代表斜率。

利用毒性单位（TU）法评估ZnO NPs 和TiO2NPs的联合毒性作用方式，参考KIM 等[29]的方法。利用测试材料的EC50值计算其毒性单位值（U）：

式中：Ci为某一测试材料的浓度，mg·L−1；UTotal为 ZnO NPs(UZnONPs)与 TiO2NPs（UTiO2NPs）的 TU 值之和。混合毒性作用方式通过比对由毒性数据计算而来的实验观察 TU 值（Uobs）和预测的 TU 值（Uexp）得到：当Uobs≈Uexp，表现为加和作用；当Uobs>Uexp，表现为协同作用；当Uobs

应用两种经典混合毒理方法即浓度加和（CA）模型和独立作用（IA）模型预测ZnO NPs 和TiO2NPs 的联合毒性。CA和IA模型如公式（4）和公式（5）所示：

式中：Cxmix为混合体系在产生x%效应时所对应的浓度，mg·L−1；Pi为组分i的浓度比值；Cxi为混合组分i在产生x%效应时所对应的浓度，mg·L−1。

式中：E（Cmix）为混合体系的效应值；E（Ci）为混合组分i的效应值。

1.6 统计分析

每组实验均设3 个平行，实验结果表示为平均值±标准差。采用SigmaPlot（14.0版）统计分析模块对实验数据进行t检验，P<0.05表示有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 物理化学性质表征

使用 TEM 技术表征了 ZnO NPs、TiO2NPs 及其二元混合物在测试介质中的形貌。如图1 所示，ZnO NPs（图1A）和TiO2NPs（图1B）在测试介质中均呈现团聚现象，当两种ENPs 共存时（图1C）颗粒间团聚行为亦存在。这是由于ENPs比表面积大、比表面能高，属于热力学不稳定体系，在水中极易发生团聚现象，并形成大小不等的团聚体。

ENPs的表面电势和水动力学直径是表征纳米颗粒在水相中分散稳定性和团聚行为的重要物理化学性质[30−31]。图 2 为 ZnO NPs、TiO2NPs 及其二元混合物在测试介质中的表面电势和团聚粒径大小随时间的变化。如图2A所示，ZnO NPs和TiO2NPs在96 h时的表面电势与0 h时相比均未发生显著性的变化。在初始时刻，ZnO NPs 和TiO2NPs 二元混合物的表面电势与各单一组分的表面电势均不存在显著差异。然而，在96 h 后，与其他处理组相比，二元混合物的表面电势发生了显著性降低（P<0.05）。这可能是由于纳米颗粒不断发生沉降，当体系达到平衡，ZnO NPs 和TiO2NPs 表面所携带的负电荷整体表现出叠加作用，故呈现出表面电势降低的现象。如图2B 所示，在96 h 后，ZnO NPs 和TiO2NPs 的水动力学直径均高于其原始粒径，进一步说明这两种ENPs 在测试介质中发生了团聚行为。ZnO NPs 在96 h 时的水动力学直径与0 h 时相比未发生显著性的变化，且TiO2NPs 的水动力学直径显著小于ZnO NPs 的水动力学直径。在0 h，二元混合物的水动力学直径介于单独存在的TiO2NPs 和ZnO NPs 的水动力学直径之间。在96 h，二元混合物的水动力学直径与ZnO NPs 的水动力学直径无显著性的差异，说明TiO2NPs可能被“包裹”在ZnO NPs之间。

应用经典DLVO 理论可有效地评估ENPs 在水相中的分散稳定性[32−33]。基于DLVO 理论，计算得到10 mg·L−1ZnO NPs、10 mg·L−1TiO2NPs 及其二元混合物的总势能曲线，如图3 所示。由于线性叠加而导致的势能曲线上出现的最大值，被称为势能峰值。通常势能峰值越大，体系保持稳定的时间越长。如图3A 所示，在0 h 时，二元混合物的稳定性介于TiO2NPs 和ZnO NPs 的稳定性之间。如图3B 所示，在 96 h 时，二元混合物的稳定性高于TiO2NPs 和ZnO NPs 的稳定性。这与前述的理化性质表征结果一致，即在96 h后二元混合物的颗粒表面电势降低，表明颗粒间以斥力为主，难以团聚而处于稳定悬浮状态。

由于ZnO NPs 表面性质活泼，进入水相后可溶解释放 Zn2+[34−35]，而共存的惰性 TiO2NPs 可利用表面效应吸附水中游离态的Zn2+，进而能够降低Zn2+的生物活性[36]。本文定量分析了 10 mg·L−1TiO2NPs 对 10 mg·L−1ZnO NPs 溶解释放 Zn2+的影响。如图 4 所示，单独存在的ZnO NPs 溶解释放Zn2+的比例为16%±1.7%，而当与TiO2NPs共存时，ZnO NPs溶解释放Zn2+的比例为2.2%±0.2%。由此可见，TiO2NPs 的存在降低了ZnO NPs溶解释放Zn2+的浓度。如图2B所示，与ZnO NPs相比，TiO2NPs具有更小的水动力学直径，这使得TiO2NPs的团聚体拥有更大的比表面积，易于通过表面吸附降低ZnO NPs 溶解释放Zn2+的量。另外，具有更小水动力学直径的TiO2NPs 可能更易于占据ZnO NPs 表面的活性位点，从而抑制Zn2+的释放。同时，如图2A 所示，TiO2NPs 在测试介质中表面电势为负，即携带负电荷，故静电作用是上述吸附过程的主要驱动力。

2.2 单一藻毒性

图 5 为不同暴露时间下 ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+对斜生栅藻和蛋白核小球藻的浓度−反应曲线（CRCs）。整体而言，ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+对两种淡水绿藻均以浓度依赖的方式产生生长抑制毒性。对于斜生栅藻，不同暴露时间下ZnO NPs（图5A）、TiO2NPs（图 5C）和 Zn2+（图 5E）的 CRCs 有明显的交叉。对于蛋白核小球藻，在48 h 和72 h 下ZnO NPs（图5B）、TiO2NPs（图5D）和Zn2（+图5F）的CRCs 向较高的生长抑制毒性区域移动。结合EC50值进一步比较 ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+的毒性大小，结果如表 1 和表2所示，结合置信区间，在不同暴露时间下ZnO NPs的EC50值均小于 TiO2NPs 的EC50值，说明 ZnO NPs 对两种淡水绿藻的生长抑制毒性均高于TiO2NPs。ZnO NPs 和TiO2NPs 在不同暴露时间下对斜生栅藻的EC50值无显著差异（表1）。ZnO NPs 和TiO2NPs 在48 h 和72 h 对蛋白核小球藻的EC50值明显小于其在24 h 的EC50值（表2），表明随着暴露时间的延长，ZnO NPs 和TiO2NPs 对蛋白核小球藻的生长抑制毒性逐渐增强。在毒性终点，ZnO NPs 对斜生栅藻的毒性高于其对蛋白核小球藻的毒性，而TiO2NPs对蛋白核小球藻的毒性高于其对斜生栅藻的毒性。这也说明，不同种类的淡水绿藻对ENPs 的敏感性存在差别，且蛋白核小球藻对ENPs的敏感性依赖于暴露时间。斜生栅藻通常由4 个细胞组成，细胞宽度为12~34µm，长度为10~21 µm，呈扁平状，而蛋白核小球藻为单细胞，呈球形，直径3~5 µm。蛋白核小球藻直径更小，比表面积更高，可维持更稳定的悬浮状态。随着暴露时间的延长，蛋白核小球藻可维持对ENPs 更有效的摄取，进而随着暴露时间的延长毒性效应逐渐增强。

如表1和表2所示，就EC50值及其置信区间而言，Zn2+与ZnO NPs对斜生栅藻生长的抑制毒性在不同暴露时间下均无显著性差异，而Zn2+对蛋白核小球藻的生长抑制毒性略低于ZnO NPs。ZnO NPs暴露浓度为10 mg·L−1时，其溶解释放 Zn2+的平均浓度为 1.6 mg·L−1。1.6 mg·L−1Zn2+对斜生栅藻在不同暴露时间的生长抑制效应分别为65%（24 h）、86%（48 h）、99%（72 h）、99%（96 h）；Zn2+对蛋白核小球藻在不同暴露时间的生长抑制效应分别为4%（24 h）、30%（48 h）、39%（72 h）。这说明Zn2+是ZnO NPs 对淡水绿藻生长抑制毒性的主要来源。前人研究也证实，ZnO NPs 表现出的毒性主要来源于其颗粒自身及其溶解释放的Zn2+[19，35]。本研究还发现 Zn2+对斜生栅藻的EC50值明显小于Zn2+对蛋白核小球藻的EC50值（表1 和表2），说明Zn2+对斜生栅藻的毒性高于对蛋白核小球藻的毒性。这也表明斜生栅藻对Zn2+的敏感性高于蛋白核小球藻对Zn2+的敏感性。综上，溶解释放的Zn2+在ZnO NPs对斜生栅藻毒性中的贡献高于其在ZnO NPs对蛋白核小球藻毒性中的贡献，ZnO NPs 对斜生栅藻的毒性主要来源于溶解释放的Zn2+，而其对蛋白核小球藻的毒性不仅来源于溶解释放的Zn2+，还来源于颗粒自身。同时，作为一种惰性ENPs 的TiO2NPs，其对淡水绿藻的毒性取决于其颗粒自身。

2.3 联合藻毒性

ZnO NPs 和TiO2NPs 的二元混合物对两种淡水绿藻生长抑制毒性的CRCs如图5G和图5H所示。二元混合物对斜生栅藻和蛋白核小球藻的EC50值如表1 和表 2 所示。与 ZnO NPs 和 TiO2NPs 的单一毒性类似，二元混合物以混合暴露浓度依赖的方式对淡水绿藻产生生长抑制毒性。同样地，二元混合物在不同暴露时间下对斜生栅藻的EC50值无显著差异（表1），二元混合物在48 h 和72 h 对蛋白核小球藻的EC50值明显小于其在24 h 时的EC50值（表2）。另外，二元混合物对两种淡水绿藻的EC50值与ZnO NPs 的EC50值并无显著差异，说明ZnO NPs 在二元混合物中对淡水绿藻的毒性起主要的作用。在不同暴露时间下，二元混合物对斜生栅藻的EC50值明显小于其对蛋白核小球的EC50值，表明二元混合物对斜生栅藻的毒性大于其对蛋白核小球的毒性。这也意味着斜生栅藻对ZnO NPs 和TiO2NPs 二元混合物的敏感性高于蛋白核小球藻对二元混合物的敏感性。

表1 通过浓度−反应曲线得到单一测试材料和二元混合物对斜生栅藻的均值效应浓度（EC50，mg·L−1）Table 1 Mean effect concentrations（EC50）derived from concentration-response curves of the single test materials and the binary mixtures to Scenedesmus obliquus（mg·L−1）

表2 通过浓度−反应曲线得到单一测试材料和二元混合物对蛋白核小球藻的均值效应浓度（EC50，mg·L−1）Table 2 Mean effect concentrations（EC50）derived from concentration-response curves of the single test materials and the binary mixtures to Chlorella pyrenoidosa（mg·L−1）

2.4 联合藻毒性作用方式及机制

基于TU 法评估ZnO NPs 和TiO2NPs 对两种淡水绿藻全浓度范围内的联合毒性作用方式。如图6A所示，ZnO NPs 与TiO2NPs 对斜生栅藻的联合毒性作用方式在毒性单位值小于10（即混合暴露浓度小于1 mg·L−1）时表现为加和，而在毒性单位值大于10（即混合暴露浓度大于1 mg·L−1）时表现为拮抗。在组分浓度较低时，ZnO NPs 与TiO2NPs 共同竞争与藻细胞间的相互作用，在所有效应达到平衡时，产生加和效应。当混合组分浓度增加，一方面ZnO NPs 颗粒间团聚性增加而抑制了Zn2+的释放，另一方面共存的TiO2NPs通过吸附作用和占据ZnO NPs 表面活性位点的方式降低了Zn2+的释放量（图4），从而导致ZnO NPs 毒性降低，混合体系产生了拮抗作用。如图6B 所示，ZnO NPs 与TiO2NPs 二元混合物对蛋白核小球藻在24 h的联合毒性作用方式表现为协同，而在48 h和72 h的联合毒性作用方式表现为拮抗。如物理化学性质的表征结果（见2.1）所示，ZnO NPs与TiO2NPs的二元混合物可产生复合团聚体，该复合体可与藻细胞直接接触，破坏藻细胞壁，并可被摄入细胞内，加上各混合组分对藻细胞的毒性作用，进而产生了协同作用。随着时间的延长，复合团聚体的尺度逐渐增大，较难进入藻细胞，毒性逐渐降低。加上TiO2NPs 通过控制ZnO NPs 溶解释放Zn2+量降低了ZnO NPs 的毒性，故混合体系在48 h 和72 h 产生拮抗作用。综上可知，ZnO NPs 和TiO2NPs 对斜生栅藻的联合毒性作用方式与混合暴露浓度有关，对蛋白核小球藻的联合毒性作用方式与暴露时间有关。同时，控制Zn2+释放量及颗粒团聚体与细胞间的相互作用是导致混合体系联合毒性作用方式变化的内在驱动力。

据报道，由颗粒诱导产生ROS 所引起的细胞内氧化应激效应是ENPs 主要的毒性作用机制[37−38]。本研究通过荧光探针法检测了两种淡水绿藻暴露于单独ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物后藻细胞内ROS 的含量变化（图7）。相比于对照组，单独ZnO NPs 和TiO2NPs 均显著诱导了两种淡水绿藻细胞内ROS水平的升高，且ZnO NPs诱导细胞内ROS升高的水平显著高于TiO2NPs，这可能会导致藻细胞产生更严重的氧化损伤，进而造成更严重的生长抑制毒性，该结果与生长抑制毒性结果一致（表1 和表2）。此外，ZnO NPs 和 TiO2NPs 二元混合物诱导的 ROS 水平也显著高于对照组，说明氧化损伤效应也可能是二元混合物对淡水绿藻产生毒性的作用机制。同时发现二元混合物诱导的ROS 水平介于ZnO NPs 和TiO2NPs 诱导的ROS 水平之间，表明这两种ENPs 间的相互作用可能调节了各自诱导藻细胞内ROS的水平。

2.5 联合藻毒性的预测

为了满足对混合污染物风险评价的需要，定量预测混合污染物的联合毒性已成为生态毒理研究的一项重要工作[39−40]。本文应用混合毒理研究中两种最常用的模型，即IA 和CA 模型预测ZnO NPs 和TiO2NPs 对两种淡水绿藻的联合毒性。如图8 所示，对于斜生栅藻，IA 模型预测的CRCs 适度的偏离了实验观察的CRCs，而CA 模型预测的CRCs 严重偏离了实验观察的CRCs。同时，IA 模型预测的CRCs 位于实验观察的CRCs 的置信区间内，而CA 模型预测的CRCs位于实验观察的CRCs 的预测区间之外，这表明IA 模型可有效预测ZnO NPs 和TiO2NPs 的联合毒性，且预测能力远高于CA 模型。此外，IA 模型预测的CRCs位于实验观察的CRCs 的左侧，表明IA 模型高估了该二元混合物的联合毒性；而CA 模型预测的CRCs 位于实验观察的CRCs 的右侧，表明CA 模型低估了该二元混合物的联合毒性。由表1 可知，对于斜生栅藻，IA 模型预测的EC50值在24 h 时与实验观察得到的EC50值无显著差异，而在 48、72、96 h 时 IA 模型预测的EC50值显著低于实验观察得到的EC50值。同时CA 模型预测的EC50值在不同暴露时间均高于实验观察得到的EC50值。这进一步说明IA 模型高估了二元混合物对斜生栅藻的毒性，而CA 模型低估了二元混合物对斜生栅藻的毒性。对比不同模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值，发现IA 模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值之间的差异明显小于CA模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值之间的差异，说明IA模型的预测能力高于CA模型。

如图9所示，对于蛋白核小球藻，IA模型和CA 模型预测的CRCs均明显偏离了实验观察得到的CRCs。在 24 h 时，IA 模型和 CA 模型预测的 CRCs 均位于实验观察的CRCs的置信区间内，而在48 h和72 h，IA模型和CA 模型预测的CRCs 均位于实验观察的CRCs的预测区间的边缘。与斜生栅藻类似，IA 模型预测的CRCs 位于实验观察的CRCs 的左侧，表明IA 模型高估了该二元混合物的联合毒性；而CA 模型预测的CRCs 位于实验观察的CRCs 的右侧，表明CA 模型低估了该二元混合物的联合毒性。由表2 可知，对于蛋白核小球藻，不同的暴露时间下，IA 模型预测的EC50值均显著低于实验观察得到的EC50值，同时CA 模型预测的EC50值均高于实验观察得到的EC50值。这也说明IA 模型高估了二元混合物对蛋白核小球藻的毒性，而CA 模型低估了二元混合物对蛋白核小球藻的毒性。对比不同模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值，发现IA 模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值之间的差异明显小于CA 模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值之间的差异，说明IA 模型的预测能力高于CA模型。

应用CA 模型和IA 模型的前提条件为混合组分具有相似的毒性作用方式[41]和非相似的毒性作用方式[42]，且混合体系的联合毒性作用方式为加和。虽然本研究ZnO NPs 和TiO2NPs 的联合毒性作用方式随着混合暴露浓度和暴露时间的变化而变化，主要表现出加和、协同及拮抗作用，但目前可有效预测ENPs协同和拮抗作用的混合毒理模型尚属空白。相比于CA模型，IA 模型对ZnO NPs 和TiO2NPs联合毒性的预测能力明显更高，且IA 模型预测的EC50值与实验观察得到的EC50值存在较小的差异。因此，IA 模型可作为预测ENPs联合毒性的预先防范工具。