绵羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2 基因多态性与胸椎数关联分析

郭思武，钟英杰，刘秋月，陶 林，刘玉芳，储明星*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056001）

哺乳动物中，亚种或家畜的品种之间经常出现脊椎数的差异，即使在同种内个体间也存在差异。胸椎数的变异在不同的物种中有着千差万别，如在人类中发生脊椎数目的变异会造成严重的遗传性疾病，影响正常生活[1]；在家畜中胸椎数的增加却是一个非常有利的经济性状，家畜胸椎和腰椎数目增加，胴体长度也会随之增加，这就给养殖企业带来更高的经济效益[2-3]。在猪[4-5]、牛[6]、羊[7-8]等物种中均已有多个基因调控脊椎数变异的相关报道。本研究选取的小尾寒羊（STH）是我国肉裘兼用型绵羊品种，具有耐粗饲、发育快、繁殖性能强、适应性强等特点[9]，而苏尼特羊（SNT）属蒙古绵羊系统中的一类，经过长期的自然选择和人工选择而形成了具有耐寒、抗旱、生长发育快、生命力强的特性，是最能适应荒漠半荒漠草原的肉用地方良种之一[10]。这2 种羊均存在高比例的多脊椎数变异，含有14 个胸椎（T14，正常绵羊为T13）的个体比例高达20%～30%，同时其肉质细嫩呈大理石纹状，富含人体必需的各种氨基酸、维生素、矿物质等营养物质，具有繁殖选育的潜力[11]。研究绵羊胸椎数相关基因已持续数年，通过分子生物学技术选育多脊椎数性状的绵羊品种已成为当前阶段的重要研究内容。因此，本研究基于先前实验的基因组重测序结果，对得到的21 个候选基因中的OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因进行胸椎数关联分析研究，以期获得新的多胸椎数相关分子标记。

OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因基于绵羊基因组重测序被筛选出来，但目前研究进展表明这3 个基因的功能在胸椎数变异中并无明显的关联性。其中，OSBPL11是氧甾醇结合蛋白（Oxysterol-Binding Protein,OSBP）家族的成员之一，OSBP 在20 世纪80 年代作为几种氧甾醇的细胞质亲和力受体被分离出来[12-14]。与OSBP 具有序列同源性的蛋白质家族存在于整个真核生物界，在哺乳动物中，OSBP 家族由12 个成员组成[15-17]。孕激素相关子宫内膜蛋白（Progestagen Associated Endo metrial Protein，PAEP）长约5 050 bp，包括7 个外显子和6 个内含子，该基因由180 个氨基酸构成，是一种分子大小为28 kDa 的糖蛋白，属于核脂钙蛋白家族[18]。PAEP是子宫内膜分泌的主要蛋白质之一，其中在雄性精囊中表达最高，PAEP还在生殖组织的其他上皮细胞中表达。醛脱氢酶1A2（ALDH1A2）是醛脱氢酶（ALDH1）家族中的一员，ALDH1 由ALDH1A1、ALDH1A2 和ALDH1A3 3 个亚科成员组成[19]。其中ALDH1A1参与视网膜氧化、乙醛代谢和环磷酰胺解毒，而ALDH1A2和ALDH1A3参与视网膜氧化为维甲酸（RA）[20]。因此，本研究利用分子遗传学手段检测了苏尼特羊和小尾寒羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的多态位点，并将这些位点与胸椎数性状进行关联分析，以揭示这3 个基因的遗传变异与多脊椎数性状之间的关系，初步推测OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因影响苏尼特羊和小尾寒羊胸椎数的具体分子机理，为提高绵羊胸椎数、改良绵羊生长发育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集 实验采集了188 只来自内蒙古巴彦淖尔乌拉特中旗的苏尼特羊的组织样品（样品组织为背最长肌）和195 只来自内蒙古巴彦淖尔及山东郓城的小尾寒羊的组织样品，采样绵羊健康状态良好。绵羊屠宰后，快速用2 mL 冻存管采集新鲜肌肉组织，并用液氮冷冻保存带回实验室转移到-80℃冰箱保存备用。记录绵羊胴体长度部分数据，其中苏尼特羊胸椎数为13 个及14个的个体分别为122 只和66 只，小尾寒羊胸椎数为13个和14 个的个体分别为137 只和58 只。

1.2 DNA 提取 使用DNA 提取试剂盒（天根生物科技有限公司，北京）进行组织DNA 提取，对提取后的组织样品用NanoDrop 2000 和1.5%琼脂糖凝胶电泳进行浓度和质量的评估，合格的DNA 样品用于后续实验。

1.3 引物设计 根据小尾寒羊和苏尼特羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的SNP 位点序列信息通过Assay design 3.1 软件进行引物设计，具体信息见表1。引物设计及合成由康普森生物技术有限公司完成。

表1 小尾寒羊与苏尼特羊OSBPL11、PAEP 和ALDH1A2 基因的引物序列

1.4 基因分型 采用Sequenom MassARRAY®SNP[21]分型技术对OSBPL11基因的g.188064535A＞G、PAEP基因的g.3541777A＞G 和ALDH1A2基因的g.49249275G＞A进行分型检测，分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA 浓度为40～80 ng/μL。分型的具体过程见Zhang 等[22]所示方法。

1.5 数据统计分析 利用Microsoft Excel 2019 软件计算各位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数、多态信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）和杂合度（Heterozygosity,He），并进行哈代温伯格平衡检验。计算群体遗传学参数的方法详见Zhang 等[22]。利用SPSS 19.0 采取一般线性模型单变量分析与单因素方差分析LSD 对OSBPL11、PAEP、ALDH1A2不同基因型的小尾寒羊和苏尼特羊进行胸椎数关联分析。模型为yijn=μ+Pi+Gj+IPG+eijn。式中：yijn代表表型值（胸椎数）；μ 代表群体均值；Pi代表品种效应（i=1，2）；Gj代表j 种基因型的影响（j=1，2，3）；IPG表示品种与基因型的互作效应；eijn代表随机误差。胸椎数用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因多态性分析 测序结果显示，383 只绵羊群体基因型及分型分别是：OSBPL11基因g.188064535A＞G 位 点AA 型350 只、AG型30 只、GG（不计入统计分析）型1 只；PAEP基因g.3541777A＞G 位点AA 型216 只、AG 型143 只、GG 型21 只；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点GG 型362 只、AG 型18 只（图1～3）。

图1 OSBPL11 基因g.188064535A＞G 位点分型结果

图2 PAEP 基因g.3541777A＞G 位点分型结果

图3 ALDH1A2 基因g.49249275G＞A 位点分型结果

PIC：OSBPL11基因g.188064535A＞G位点中小尾寒羊和苏尼特羊PIC 分别是0.06 和0.09，均属于低度 多 态（PIC＜0.25）；PAEP基 因g.3541777A＞G 位点中小尾寒羊和苏尼特羊PIC 分别是0.32 和0.27，均属于中度多态（0.25＜PIC＜0.50）；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点中小尾寒羊和苏尼特羊PIC 分别是0.05 和0.04，均属于低度多态（PIC＜0.25）（表2）。在卡方检验值方面，OSBPL11基因g.188064535A＞G位点小尾寒羊与苏尼特羊的卡方检验值分别为0.631 和0.439；PAEP基因g.3541777A＞G 位点小尾寒羊与苏尼特羊的卡方检验值分别为0.427 和0.930；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点小尾寒羊与苏尼特羊的卡方检验值分别为0.685 和0.793。结果表明，小尾寒羊和苏尼特羊中3 个SNPs 位点均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

表2 3 个位点在小尾寒羊和苏尼特羊中的群体遗传学分析

2.2OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3个位点与胸椎数的关联分析 由表3 可知，OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 个突变位点均与胸椎数不显著相关。对188 只苏尼特羊和195 只小尾寒羊2 个种群单独进行胸椎数关联分析，结果发现，ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点在苏尼特羊中野生型个体（GG）的胸椎数显著低于突变杂合个体（AG），其他位点与胸椎数均不显著相关；而在小尾寒羊中OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 个突变位点与胸椎数均不显著相关，表明ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点与苏尼特羊的胸椎数变化有关（表4）。

表3 OSBPL11、PAEP 及ALDH1A2 基因位点与绵羊胸椎数关联分析结果

表4 3 个位点各基因型与小尾寒羊和苏尼特羊胸椎数最小二乘均值及标准误

2.3OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3 个位点与小尾寒羊胴体长的关联分析 由表5 可知，这3 个突变位点各基因型与小尾寒羊胴体长均不显著相关。

表5 各位点基因型与小尾寒羊胴体长的关联分析（平均值±标准误）

3 讨论

哺乳动物脊椎是由胚胎发育到原肠胚时中胚层分化而来，而控制胸椎生长的初级神经胚的发育变化主要受到骨形成蛋白（BMP）的浓度控制。其中发育的每个阶段都是极为复杂的工程，任何地方出错都有可能导致胸椎的异常分化[23-24]。家畜多脊椎性状是指家畜胸椎数和腰椎数比正常个体增多的现象。早在20 世纪中期，人们就发现家畜的胸腰椎数目存在变异。脊椎数的增多可以间接地提高家畜的体长、体重、产肉量和肋骨数等性状，从而提高其经济效益。所以家畜脊椎数变异的遗传改良也在近年来得到了深入的研究。

猪多脊椎性状候选基因的挖掘始于QTL 定位。由于猪的繁殖速度较其他家畜快，使得在利用家系进行多脊椎性状相关QTL 定位研究中较其他单胎家畜具有明显的优势，这也是猪繁殖研究中获得成果较其他家畜多的原因之一。早在2000 年，Wada 等[25]首次将脊椎数相关QTL 位点定位在猪1 号染色体和2 号染色体上。其中1 号染色体上脊椎数相关的QTL 与Rohrer 等定位在1 号染色体与胴体长度相关的QTL 在位置上很接近[26]，提示脊椎数与胴体长可能存在相关性。在此基础上，该研究团队后期研究又发现在猪1 号染色体和7 号染色体各存在1 个与脊椎数相关的QTL 位点[27]，该结果后来也被在其他不同猪品种上的研究所证实[28-29]。与猪相比，羊脊椎数变化范围要小很多。张立岭等[3]研究发现，蒙古羊每增加1 枚胸椎或腰椎，脊柱就加长约2.40 cm或3.50 cm。无论多1 枚胸椎还是腰椎，绵羊的活重、胴体重、净肉重和眼肌面积均明显增加，其中净肉平均增加4 kg 以上。该研究结果与猪的研究结果基本一致。最早在大白猪群体中发现控制脊椎数性状的VRTN基因首次被证实为影响脊椎数性状的主效基因[30]，随后又发现了更多影响胸椎数性状的基因，如NR6A1[7]、Hoxc[31]和TGFβ3[32]等，而在苏尼特羊中已被证实VRTN对胸椎数的影响仍然存在[33]。

查阅OSBPL11基因相关文献发现，该基因的表达在各物种间可能存在差异，人OSBPL11基因的功能与脂肪形成有关，绵羊中却在肺脏和淋巴组织中高度表达。目前OSBPL11所在家族中的其他成员OSBP 相关（ORP）蛋白或OSBP 样（OSBPL）蛋白更多的研究主要聚焦在哺乳动物和酵母系统中，主要参与控制细胞脂质代谢、囊泡运输和细胞信号传导[34-35]，在脊椎数变异等骨相关的研究鲜少。查阅PAEP基因相关文章发现，还没有发现PAEP在绵羊胸椎数变异研究的报道，已知的PAEP 蛋白亚型有4 种，分别为glycodelin A（来自羊水、内膜和母体血清）、glycodelin S（来自雄性精浆和精液囊泡）、glycodelin F（来自卵泡液和输卵管）和glycodelin C（来自卵丘），这些亚型的蛋白骨架完全相同，区别仅在糖基结构部分，表现出不同甚至相反的功能，提示糖基化对蛋白功能具有重要的调节作用[36]。且在NCBI 中发现PAEP主要在绵羊乳腺中高度表达，其原因是由于PAEP的表达受孕酮/孕激素、松弛素和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的调控[37]。

ALDH1A2是醛脱氢酶1（ALDH1）家族的一员，而ALDH1 是通过氧化全跨视网膜（all-trans-retinal）和9-顺视网膜（9-cis-retinal）产生维甲酸（RA）的主要酶，主要参与细胞分化、细胞周期阻滞最终凋亡等生物学功能[38-40]。ALDH1A2的功能与胸椎数性状没有直接关系，但是本研究结果表明，ALDH1A2基因在存在品种效应的条件下虽与胸椎数呈不显著关系，但在单独群体中ALDH1A2基因的突变位点可以显著提高苏尼特羊的胸椎数，其机理有待进一步研究。

4 结论

在小尾寒羊中OSBPL11基因g.188064535A＞G、PAEP基因g.3541777A＞G 和ALDH1A2基 因g.49249275G＞A位点与胸椎数和胴体长无显著关联。OSBPL11基因g.188064535A＞G 和PAEP基 因g.3541777A＞G 位 点与苏尼特羊胸椎数性状无显著关联；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位点突变与苏尼特羊胸椎数呈显著相关。ALDH1A2基因可作为潜在的多胸椎数的分子标记。