滇重楼及其近缘种的表型变异与资源评价

王元忠 沈涛 张金渝

摘  要：以滇重楼及其近缘种为对象，通过表型性状调查结合多元统计分析，研究重楼属药用植物的表型变异及各性状对药材产量的影响。结果显示：16个表型性状中，株高、茎粗、叶形、叶宽、叶柄长等性状变异较大（CV值大于40.00%），萼片长、萼片数、花瓣数种间变异较小（CV值均小于25.00%）。5种重楼属植物表型性状的遗传多样性指数（H）为2.03～0.82;滇重楼和多叶重楼性状的遗传多样性指数平均值最高。主成分分析结合偏最小二乘-判别分析显示，多叶重楼、滇重楼的叶部和花部位性状与其他物种差异较大;南重楼和西畴重楼的株高、茎粗、叶宽、根茎长、根茎直径、根茎鲜重与其他重楼属物种差异明显;5种重楼属植物中南重楼与西畴重楼形态最接近，较难区分。相关性分析表明，重楼属植物地上性状与地下性狀呈显著或极显著的正相关（P<0.05或P<0.01）;进一步利用变量投影重要性指标分析发现，根茎直径、根茎长、叶柄长、叶长、叶宽、花梗长、株高和花瓣长是筛选药用重楼高产种源的关键性状。

关键词：滇重楼;近缘种;表型变异;遗传多样性;资源评价

中图分类号：S567      文献标识码：A

Phenotypic Variation and Resource Evaluation of Paris polyphylla var. yunnanensis and Its Relative Species

WANG Yuanzhong1， SHEN Tao2， ZHANG Jinyu

1. Medicinal Plants Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan 650200， China; 2. College of Chemistry， Biology and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi， Yunnan 653100， China

Abstract： In the present study， the phenotypic characteristics of Paris polyphylla var. yunnanensis and its relative species were investigated and analyzed. The variations of the phenotypic traits were studied through the investigation of traits and multiple statistical analyses. The plant height， stem diameter， leaf shape index， leaf width， petiole length， and traits had high values of interspecies variation coefficient （CV > 40.00%）. Meanwhile， the traits of flowers， such as calyx length and calyx width， had lower CV value （< 25.00%）. Genetic diversity indexes （H'） was ranged from 2.03 to 0.82. Paris polyphylla var. yunnanensis and P. polyphylla had the highest mean value of H' in the five species. The principal component analysis combined with Partial least squares-discrimination analysis showed the phenotype of leaf and flower were the key traits for discrimination between P. polyphylla and Paris polyphylla var. yunnanensis. Compared P. vietnamensis and P. cronquistii var. xichouensis with the other three species， plant height， stem diameter， leaf width， rhizome length， rhizome diameter， and rhizome fresh weight were different. The samples of P. vietnamensis， and P. cronquistii var. xichouensi were hard to distinguish from each other. Correlation analysis found that overground traits were significantly positively correlated with underground traits （P < 0.05 or P < 0.01）. Combined with VIP analysis， it could be found that rhizome diameter， rhizome length， petiole length， leaf length， leaf width， pedicel length， plant height， and petal length were key traits for selecting germplasm resources of high-yielding medicinal Paris species.

Keywords： Paris polyphylla var. yunnanensis; relative species; phenotypic variation; genetic diversity; resource evaluation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.013

滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）隶属百合科（Liliaceae）重楼属（Paris L.），是云南具有地域特色的药用植物，与同属植物七叶一枝花（P. polyphylla var. chinensis）被《中国药典》2020版收录作为传统名贵药材重楼的主要基源植物[1]。滇重楼干燥根茎具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是“云南白药”“宫血宁胶囊”“季德胜蛇药片”等80余种中成药的主要原料[2]。随着工业化生产需求增加，滇重楼野生资源遭到人为过度采挖，濒临灭绝，其替代药源的开发与资源评价迫在眉睫[2-3]。

南重楼（P. vietnamensis）、西畴重楼（P. cronquistii var. xichouensis）、多叶重楼（P. polyphylla）等重楼属植物的药用价值已受到学者广泛关注。赵飞亚等[4]利用超高效液相色谱（UPLC）技术对10种重楼化学成分进行定量分析，认为多叶重楼质量优于《中国药典》收录品种，而南重楼与滇重楼质量相近。Wang等[5]基于重楼皂苷（polyphyllin）Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ及纤细薯蓣皂苷（gracillin）定量分析结果，发现西畴重楼药效成分含量较高的，可作为滇重楼的替代药源。杨远贵等[6]对重楼属植物化学成分与药理活性进行综述报道，表明该属大部分物种具有药用价值，药用资源开发潜力巨大。

表型性状是生物资源评价与种质筛选的基础，也是衡量物种多样性的重要指标。对药用植物表型性状的遗传多样性进行评价，有助于后续药材优异基因挖掘、品种选育改良[7-9]。重楼属植物形态变异大，种间甚至同种不同种群间的性状特征常有交叉重叠，不同文献记载的重要性状和分类观点不统一，阻碍着该属药用资源的正确认识及客观评价[10-11]。除种源鉴别问题，王骞等[12]研究发现表型性状可能影响药材质量，叶长、叶形指数等性状与重楼药用部位药效成分含量呈现

正相关关系。重楼药材生产过程中，亟待寻找表现直观、易于识别、与生产直接相关的植物性状，以协助药用重楼种源鉴别与良种筛选[13-14]。

目前，药用重楼表型变异及相关资源评价主要集中于滇重楼[14-15]，其他重楼属植物报道较少[16-17]。本研究选取‘滇重楼‘七叶一枝花‘南重楼‘西畴重楼和‘多叶重楼为研究对象，结合植物形态学、数量分类学的理论与方法，研究5种重楼属植物表型性状种间变异及其多样性，探讨表型性状对药源鉴别和优质高产种源筛选的实际意义，研究以期为滇重楼及其近缘种的鉴别与资源评价提供理論依据。

1  材料与方法

1.1  材料

分别从中国云南、广西及越南高平省收集‘滇重楼‘七叶一枝花‘南重楼‘西畴重楼和‘多叶重楼5种重楼属植物6个种群的野生资源，每个种群选取生长5 a左右的植株根茎，播种于资源圃相同遮阴棚内。遮阴棚的遮光度为50%，播种株行距10 cm×15 cm，种植过程中，不施肥，统一除草和浇水管理。在花期统一采收植株并测定农艺性状。实验样品信息详见表1。

实验地点位于云南省农业科学院药用植物研究所种质资源圃内，经纬度为102.98°E，25.18°N;海拔为1985 m，栽培土壤为红壤，气候带类型为北亚热带，年平均温度14～16 ℃，年平均最高温度30～32 ℃，年平均最低温度–5～–2 ℃，年均降水量900～1000 mm，年日照时数2108 h，植物生长期为220～280 d。

1.2  方法

1.2.1  形态指标的测定  选取16个与药材品质相关的表型性状进行测定[9， 14]。地上性状包括株高、茎粗、叶片数、叶长、叶宽、叶形指数、叶柄长、花梗长、萼片数、萼片长、萼片宽、花瓣数、花瓣长;地下性状包括根茎长、根茎直径、根茎鲜重。以上性状每一种群测定株数见表 每一植株的每个性状重复测定3次，取平均值。株高、叶长、叶宽、叶柄长、花梗长、根茎长采用直尺测量;茎粗、萼片长、萼片宽、花瓣长和根茎直径采用游标卡尺测量。根茎鲜重用感量0.01 g电子天平称重。

1.2.2  数据处理  表型性状的平均值、标准差、变异系数及遗传多样性指数用Excel计算，单因素方差分析、相关性分析用SPSS 20.0计算;PCA、PLS-DA、PLS-R和VIP分析用SIMCA 14.1完成。

单因素方差分析（one-way ANOVA）和scheffé test用于比较5种重楼属植物表型性状的种间异性;变异系数（coefficient of variation， CV）用于评价滇重楼及其近缘种的表型变异程度;依据表型性状平均值（Mean）和标准差（SD）计算遗传多样性指数（H=-∑PilinPi，Pi表示第i级的频率）[18];主成分分析（principal component analysis， PCA）、偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discrimination analysis， PLS-DA）用于重楼样品的分类研究;相关性分析（pearson correlation analysis）初步研究各性状间的相互关系，

利用偏最小二乘-回归分析（partial least squares- discrimination analysis， PLS-R）构建表型性状与药材产量间的关系模型[19];变量投影重要性指标（variable projection importance indicator， VIP）用于筛选影响根茎产量的关键性状[19]。

2  结果与分析

2.1  5种重楼属植物的表型性状比较

单因素方差分析显示（表2），‘滇重楼花部萼片宽度、花瓣长度数值较高，与其他物种差异显著（P<0.05）。‘南重楼和‘西畴重楼的叶长、叶宽、叶柄长、花梗长数值较高，‘多叶重楼中数值最低，呈显著差异（P<0.05）。‘南重楼萼片长、花瓣长数值较高，与其他重楼属植物有显著差异（P<0.05）。‘滇重楼‘南重楼和‘西畴重楼叶片形状较接近，叶形指数为1.99～2.20;‘七叶一枝花叶片狭长，叶形指数最高，叶形指数为（4.99±0.56）;‘多叶重楼叶片数目最多，七叶一枝花次之，其他重楼样品间差异不显著（P>0.05）。地下性状中，‘西畴重楼根茎鲜重、根茎长和根茎直径数值均最高，而‘多叶重楼地下各性状数值均最低，二者差异显著（P<0.05），其他重楼属植物地下性状差异未达显著水平（P>0.05）。

2.2  表型变异与遗传多样性分析

从表3可见，16个性状中，株高、茎粗、叶形、叶宽、叶柄长、花梗长、花瓣长和根茎鲜重是种间变化较大的性状，以上性状CV值均大于40.00%。其中，地下性状根茎鲜重CV值达92.69%;花部性状萼片长、萼片数、花瓣数种间变化较小，CV值均小于25.00%;茎叶性状中，叶片数变化较小（CV值为25.73%），其余性状均有明显变异。

遗传多样性指数计算显示（表4），5种重楼属植物16个性状的遗传多样性指数为2.03～0.82，其中花梗长、根茎直径在‘滇重楼中数值最大，分别为2.00和2.03;株高、叶宽及叶形指数在‘多叶重楼中也较高，数值分别为2.01、2.01和2.02;叶片数在‘滇重楼及‘西畴重楼中遗传多样性指数最低，数值分别为0.82和0.86;萼片数、花瓣数在‘七叶一枝花和‘西畴重楼中最低，数值均≤0.98。综合比较发现，‘滇重楼和‘多叶重楼16个性状的遗传多样性指数平均值最高;各性状中，株高、叶形、花梗长、萼片长等表型变异式样丰富，具有较高的遗传多样性。

2.3  基于表型性狀的PCA与PLS-DA分析

以‘滇重楼‘七叶一枝花‘南重楼‘西畴重楼和‘多叶重楼的16个性状为变量利用主成分分析对样品间的分类与聚集趋势进行初步探索。结果显示（图1A），基于表型数据大部分样品依照其所属类群进行划分，‘七叶一枝花与‘滇重楼‘多叶重楼形态较为接近;‘多叶重楼及其变种与‘南重楼及‘西畴重楼在形态上差异较明显，而‘南重楼和‘西畴重楼样品间分离趋势不明显共同聚为另一类。结合主成分分析载荷图发现（图1B），叶片数、叶形指数、花瓣数、萼片数是区分‘多叶重楼与其他重楼属植株的重要性状;萼片宽、萼片长及花瓣长在区分‘滇重楼时贡献较大;而‘南重楼与‘西畴重楼的茎粗、株高、叶宽、根茎长、根茎直径、根茎鲜重、根茎长等性状与其他重楼属植物差异较明显。

在PCA分析基础上，采用有监督的偏最小二乘-判别分析建立5种重楼属植物的分类模型。结果显示（图2A），药用重楼样品可被明显的区分为4类，‘滇重楼聚为第1类;‘七叶一枝花‘多叶重楼分别聚为第2类和第3类，但两个物种间有少量样品难以区分;‘南重楼与‘西畴重楼最难区分，总体聚为第4类。为证明分类模型的有效性，对分类结果进行了200次置换重要性检验，结果显示（图2B），位于图形左边的R2Y和Q2Y均低于右侧的R2Y和Q2Y值，且R2回归线截距小于0. Q2回归线截距小于0，表明模型预测结果未出现过拟合，分类结果较准确。

2.4  性状间的相关性分析

Pearson相关性分析显示，‘滇重楼‘七叶一枝花和‘多叶重楼地上多个性状数值变化与植株根茎长、根茎直径呈显著或极限显著相关（P<0.05或P<0.01）。株高、茎粗数值的增加有助于上述3种重楼地下性状数值的增长（P<0.05或P<0.01）;叶部性状中，叶长、叶宽、叶片数与根茎鲜重和根茎直径呈显著正相关（P<0.05或P<0.01）;花部性状中，‘滇重楼‘多叶重楼地下性状与花梗长、花萼数、花瓣数等性状呈显著或极显著正相关（P<0.05或P<0.01）。‘南重楼和‘西畴重楼地上性状与地下性状数值的相关性较弱，但叶柄长与根茎直径、根茎鲜重呈显著正相关（P<0.05）。

为进一步建立药用重楼高产种源的快速筛选方法，将85份药用重楼的株高、茎粗、叶片数等15个性状作为自变量（X），样品根茎部位鲜重为因变量（Y）进行偏最小二乘-回归分析。结果显示，回归模型R2X（cum）为0.749，即模型对变量X的解释能力为74.90%;R2Y（cum）为0.872，表明提取的主成分能解释的因变量变异87.20%;Q2（cum）为0.813，大于0.50，显示预测结果较理想。绘制VIP得分图显示（图3A），根茎直径、根茎长、叶柄长、叶宽、叶长、花梗长和株高共7个性状的VIP值大于1.00，表明上述性状对预测重楼根茎鲜重具有重要作用是筛选药用重楼高产种源的关键性状。

此外，利用‘滇重楼‘七叶一枝花‘多叶重楼及‘西畴重楼地上性状与药材根茎鲜重进行回归分析发现，回归模型R2X（cum）为0.64，R2Y（cum）为0.772，Q2（cum）为0.67 表明上述4种药用重楼仅依据地上性状也能对药材产量进行预测。其中重要地上性状排序依次为（VIP值大于0.80）：叶柄长>叶长>叶宽>花梗长>株高>茎粗>叶片数（图3B）。

3  讨论

采用ISSR（inter simple sequence repeat）、RSAP（restriction site amplification polymorphism）、SCOT（start codon targeted polymorphism）等分子标记对多叶重楼、滇重楼、狭叶重楼（P. polyphylla var. stenophylla）、球药隔重楼（P. fargesii var. fargesii）等物种的研究发现，该属植物遗传多样性水平较高，种内和种间具有丰富的遗传变异[20-23]。本实验研究显示，5种重楼属植物16个性状的遗传多样性指数为2.03～0.82，表型性状种间呈现丰富多样的变异式样。根茎是重楼的入药部位。‘滇重楼‘七叶一枝花‘西畴重楼和‘多叶重楼的研究发现，根茎鲜重种间变异达92.69%。丰富的性状变异有助于后续栽培驯化及特异种质资源的发掘。

重楼属种及种下形态分类较困难，如‘南重楼在云南文山西畴、红河建水一带形态与‘滇重楼较接近，而在瑞丽至西双版纳勐腊一带与‘多叶重楼较接近[10]。李恒等[10]依据重楼属植物形态特征及演化趋势，将重楼分为2个亚属，8个组，24個种。其中，‘滇重楼‘七叶一枝花‘多叶重楼‘西畴重楼和‘南重楼均属侧膜亚属的植物，‘西畴重楼为凌云重楼的变种，‘南重楼为独立种，‘滇重楼和‘七叶一枝花为多叶重楼的变种。Ji等[20]基于细胞核ITS序列和质体DNA序列数据对21种重楼属植物进行分类研究，结果显示，‘南重楼与‘西畴重楼亲缘关系较接近，‘七叶一枝花与以上物种亲缘关系较远，与‘多叶重楼亲缘关系更近。国内学者利用叶绿体matK基因和RSAP分子标记对重楼属植物的遗传关系进行研究，发现‘滇重楼‘七叶一枝花和‘多叶重楼可划分为一类，并建议将‘滇重楼‘七叶一枝花作为多叶重楼的变形处理[21-22]。本研究基于16个表型性状的PCA及PLS-DA分析显示，‘西畴重楼和‘南重楼样品多聚为一类;‘滇重楼‘七叶一枝花是多叶重楼的变种，3个物种各性状的数量特征具有一定的相似性，但大部分样品可以被区分。各性状中，叶部和花部性状是区分‘多叶重楼及其变种的关键性状，而地下性状在区分‘南重楼‘西畴重楼时贡献较大。

植物性状间常存在相互联系，以上关系可辅助根茎类药材地下性状的筛选[24]。地黄（Rehmannia glutinosa）研究显示，植株块根鲜重与茎叶性状相关性显著，通过对冠幅、茎粗、叶片大小等性状的选择可提高地黄单株块根产量[25]。高晓霞等[26]对不同品系黄芩（Scutellaria baicalensis）农艺性状的相关性进行分析，发现芦头直径与根鲜重存在极显著的相关性，该结论可协助黄芩药材的品种选育。‘滇重楼‘七叶一枝花及‘多叶重楼是目前栽培较多、经济价值较高的药用重楼，市场对高产优质种源需求迫切。然而实际生产中重楼根茎性状在选育过程中难以直接观测。5种重楼属植物表型性状相关性分析显示，地上、地下多对性状间存在正相关关系。‘滇重楼‘七叶一枝花‘多叶重楼地上性状与地下根茎鲜重相关性较强，通过建立回归模型，叶柄长、叶长、叶宽、花梗长、株高、茎粗和叶片数可间接预测地下药用部位产量，今后研究可进一步增加样本量完善预测模型，服务实际生产，提高种源的筛选效率，缩短筛选周期。

参考文献

[1]  国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 271-272.

[2]  陶爱恩， 赵飞亚， 李若师， 等. 重楼产业现状及发展对策[J]. 中草药， 2020， 51（18）： 4809-4815.

[3]  Cunningham A B， Brinckmann J A， Bi Y F， et al. Paris in the spring： a review of the trade， conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of Paris Polyphylla （Trilliaceae）[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2018， 222： 208-216.

[4]  赵飞亚， 陶爱恩， 管  鑫， 等. 重楼多指标UPLC定量分析及其化学品质综合评价[J]. 中草药， 2020， 51（18）： 4763-4770.

[5]  Wang Y Z， Liu E H， Li P. Chemotaxonomic studies of nine Paris species from China based on ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2017， 140： 20-30.

[6]  杨远贵， 张  霁， 张金渝， 等. 重楼属植物化学成分及药理活性研究进展[J]. 中草药， 2016， 47（18）： 3301-3323.

[7] 张深梅， 奚建伟， 洪俊彦， 等. 大别山山核桃果实与叶片性状的表型多样性研究[J]. 林业科学研究， 2020， 33（1）： 152-161.

[8]  李秀诗， 付瑜华， 周  祥， 等. 基于表型性状的薏苡初级核心种质库构建[J]. 热带作物学报， 2020， 41（4）： 669-675.

[9]  王春芳， 余兴华， 王先宏， 等. 基于主要表型性状的不同采集地斑茅种质资源遗传多样性分析[J]. 热带作物学报， 2020， 41（6）： 1108-1116.

[10]      李  恒. 重楼属植物[M]. 北京： 科学出版社， 1998： 12-64.

[11]      赵万顺， 高文远， 黄贤校， 等. 重楼属药用植物的数量分类学研究[J]. 中国中药杂志， 2010， 35（12）： 1518-1520.

[12]      王  骞， 丁  媛， 杨  敏， 等. 滇重楼品质与产地和表型性状相关性分析[J]. 中国中药杂志， 2019， 44（15）： 3203-3212.

[13]      SONG Y， LI M F， XU J， et al. Polymorphic microsatellite markers in the traditional Chinese medicinal plant Paris Polyphylla var. Yunnanensis[J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（3）： 9939-9942.

[14]      李  戈， 王艳芳， 唐  玲， 等. 滇重楼表型性状变异、主成分、相关及通径分析[J]. 中药材， 2015， 38（7）： 1339-1342.

[15]      唐  玲， 王艳芳， 李荣英， 等. 滇重楼不同居群的表型多样性研究[J]. 中国农学通报， 2013， 29（18）： 89-95.

[16]      翁  周， 王  麗， 唐  锐， 等. 多叶重楼的形态变异研究[J]. 四川大学学报（自然科学版）， 2008， 45（5）： 1228-1234.

[17]      童  凯， 孙  旭， 姜美杰， 等. 华重楼的形态多样性及其与单株产量和质量的关系[J]. 中国中药杂志， 2017， 42（7）： 1300-1303.

[18]      刘三才， 郑殿升， 曹永生， 等. 中国小麦选育品种与地方品种的遗传多样性[J]. 中国农业科学， 2000， 33（4）： 20-24.

[19]      崔丹丹， 曾令杰， 黄嘉玲， 等. 基于主成分聚类和PLS回归分析的穿心莲质量等级评价研究[J]. 中草药， 2019， 50（13）： 3200-3206.

[20]      Ji Y H， Fritsch P W， Li H， et al. Phylogeny and classification of Paris （Melanthiaceae） inferred from DNA sequence data[J]. Annals of Botany， 2006， 98（1）： 245-256.

[21]      马  剑， 李迪强， 张于光， 等. 基于matK基因的几种重要重楼属植物遗传关系分析[J]. 中国中药杂志， 2010， 35（1）： 18-21.

[22]      辛本华， 田孟良， 吴镔锣， 等. 重楼属植物遗传多样性的RSAP标记[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（24）： 3425-3427.

[23]      李  壮， 辛本华， 杨  华， 等. 重楼属植物遗传多样性的SCOT标记[J]. 广西植物， 2014， 34（3）： 315-319， 368.

[24]      王国勋， 于顺利， 方伟伟， 等. 植物群落构件的协同性研究进展[J]. 生态学杂志， 2014， 33（10）： 2824-2833.

[25]      王丰青， 田云鹤， 黄  勇， 等. 18个地黄种质的表型性状及相关统计学分析[J]. 植物资源与环境学报， 2015， 24（1）： 28-35.

[26]      高晓霞， 陈  君， 徐  荣， 等. 不同品系黄芩主要表型性状的差异与相关分析[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（2）： 205-210.

责任编辑：黄东杰