融安金桔新梢霉变致病菌的鉴定和室内抑菌试验

郑梦琪，曹津桥，刘瑞琪，曾 晴，莫亿伟，吴齐仟

(1 绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴，312000；2 广西壮族自治区融安县金桔研究所，广西融安，545400)

融安金桔(金柑)是广西融安名优水果，近年在春夏交接温暖多雨季节，发现新梢感染一种真菌病害，导致叶片霉变受损、形成黑色病斑，严重时新梢枯萎脱落，病因未见报道。引起柑桔枝条或叶片出现黑色斑点的主要有青霉病、绿霉病等[1-2]，但融安金桔新梢感病症状与青霉病、绿霉病等有明显不同，因此其致病菌种类还有待于深入探究。咪唑类杀菌剂咪鲜胺乳油(施保克)对青霉病、蒂腐病和炭疽病等均有较好的防治效果[3]，推测咪鲜胺也可能对防治融安金桔新梢上新发生的真菌病害有潜在价值。在多种致病真菌中，毛霉广泛腐生在土壤、动物粪便和动植物残体上[4]，致腐毛霉会使采摘后果蔬发病，导致贮藏期缩短，造成腐烂[5-7]，比如：草莓感染致腐毛霉后会加速果实腐烂并成为优势菌群[8]。从融安金桔新梢叶片霉变病症状来看，其致病菌有可能与毛霉有关，为探明病原及其生物学特性等，笔者开展了本研究。

1 材料与方法

1.1 病原菌纯化及其致病性鉴定于2019年3月25日从广西融安县金桔基地采集发病新梢，参考陈瑶等[9]的方法，切取新梢叶片病变和健康交接处组织，先用75%乙醇表面消毒1 min，再用1.0%NaClO溶液消毒5 min，最后用无菌水冲洗3次，晾干置于PDA培养基上，28 ℃条件下黑暗培养，对具有典型特征的菌落多次纯化。将纯化后的菌种培养4 d后，用无菌水将孢子洗脱，将孢子浓度调整为105个/mL，用钢针刺伤发芽后10 d的健康新梢幼嫩叶片，将孢子悬液涂抹于刺伤部位，再用无菌塑料袋包裹，观察叶片发病情况，从发病叶片分离纯化菌种，判断其是否与原来接种的菌种一致。

1.2 病原菌和可能宿主鉴定病原菌接种在PDA培养基上，28 ℃黑暗培养，记录生长菌丝的颜色和形态特征[10]，再显微观察菌丝体和孢子形态。挑取培养3 d后菌落边缘的菌丝0.5 g，利用北京天根公司生产的真菌DNA基因组试剂盒提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用引物ITS5：F5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4：R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，参考周雪芳等[11]和莫亿伟等[12]的方法扩增真菌28S rDNA的ITS区域(ITS1、5.8S、ITS2)。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后拍照。将PCR产物送到上海生工公司测序，所得序列输入GenBank，以Blast程序与已有序列比对，相似性达98%以上时，可确定为某一类微生物。用MEGA X软件构建系统发育树，用于分析致病菌的亲缘关系。

1.3 病原菌生物学特性分析参考张润光等[13]方法进行，将病原菌100 μL孢子悬浮液(浓度为105个/mL)接种到PDA培养基上，分别放在20、25、30、35和40 ℃的条件下黑暗培养，以确定最适生长温度。将病原菌接种到pH值为4、5、7、9、11的PDA培养基上培养，以确定最适pH值。将病原菌接种到PDA培养基后，进行连续光照和黑暗两种处理，以确定光照对菌丝生长的影响。以察氏培养基为基础，分别用等质量麦芽糖、D-果糖、半乳糖、木聚糖、葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇代替蔗糖为碳源进行培养，以确定最适碳源。以察氏培养基为基础，分别用等质量牛肉浸出膏、蛋白胨、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、尿素、NaNO3和NH4NO3为氮源进行培养，以确定最适氮源。以上几种处理均在28 ℃黑暗培养。在培养第4天时，用十字交叉法测量菌落直径。

1.4 咪鲜胺锰盐和硼酸抑菌试验在PDA培养基上分别加入0.10%和0.20%咪鲜胺锰盐(由江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司生产50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂配制，以有效成分计)，0.05%、0.10%和0.20%硼酸，以空白为对照，然后接种菌株，28 ℃黑暗培养4 d，每天用十字交叉法测量菌落直径。参考莫亿伟等[12]的方法，用菌落直径来表示药剂处理的抑菌能力，菌落直径越小抑菌效果越强。

1.5 硼酸对细胞膜损伤试验碘化丙啶(Propidium iodide，PI)能透过受损的细胞膜与细胞内DNA结合，DNA含量越高，PI荧光强度越强，而PI无法进入细胞膜完整的细胞，所以活细胞基本不能染色[14]。基于抑菌试验结果，在PDA内分别添加0%和0.1%硼酸后，接种菌株，28 ℃黑暗培养4 d，然后用镊子挑取菌落边缘的部分菌丝及孢子，参考Lai等[15]的方法用10.0 μg/mL PI进行染色，用荧光显微镜观察菌丝和孢子的染色情况，染色越深则表明细胞膜完整性越差。

1.6 数据分析所有试验至少重复3次，用平均值±标准差表示结果。用SPSS 14.0软件进行数据分析，用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离纯化及形态学鉴定在温暖多雨的初春季节，田间金桔发病新梢及幼嫩叶片发霉、变黑，最终枯萎脱落(图1a)，健康新梢叶片通过刺伤法接种分离纯化菌株8 d后得到相似的发病症状(图1b)。纯化后的病原菌在PDA培养基上的菌落呈圆形，气生菌丝绒状，菌落边缘呈灰色、中间部分由于产生分生孢子而呈黑色，无贴壁生长特性(图1c)。菌丝有横隔，呈分枝状(图1d)。分生孢子呈短棒状或杆状，两头圆或一端稍尖(图1e)。经PCR扩增得到的rDNA-ITS序列目的片段大小为558 bp(图1f，g)，在NCBI数据库利用BLAST进行比对，结果发现与Mucorcircinelloides(登录号MH854658)的同源性为99%。根据BLAST比对结果，利用MEGA X软件构建N-J法系统发育树(图1h)可知，与纯化菌株JinJu-01亲缘关系较近的均为毛霉，其中亲缘关系较近的有6株菌株，分别为MucorcircinelloidesLZ38(登录号MN533750.1)、MucorlusitanicusCBS 108.17(MH854658.1)、MucorcircinelloidesLZ44(MN533755.1)、Mucorsp. 21IN02(JX270569.1 )、Mucorsp. JJP-2009(FJ210526.1)、MucorlusitanicusCBS 852.71(MF495058.1)。菌株JinJu-01与上述6株菌株的亲缘关系置信率高达96%，再结合形态学观察结果，鉴定该病原菌(JinJu-01)为毛霉属Mucorsp.。

注：a. 新梢感病症状；b. 重新接种后新梢的感病症状；c.菌落形态；d.菌丝形态(标尺为200 μm)；e.分生孢子形态(标尺为50 μm)；f. ITS区PCR 扩增电泳(M：DL2000 Marker；1～4为菌株); g. PCR产物测序结果; h.系统发育树。图1 融安金桔新梢霉变症状及其致病菌的分离纯化和鉴定

2.2 病原菌生物学特性培养4 d发现，菌落在15～35 ℃的温度下均可生长，但在10和40 ℃的条件下菌落均无法生长。菌落可生长不同温度下的菌落直径排序为25 ℃(35.75 mm)>20 ℃(28.67 mm)>30 ℃(21.32 mm)>15 ℃(15.56 mm)>35 ℃(9.25 mm)，相互间差异有显著性(p<0.05)。说明，25 ℃左右是菌丝生长最适温度，与田间金桔新梢发病的温度吻合，而过低或过高的温度均不利于菌丝生长。

培养4 d发现，该菌对pH值的适应范围比较广，在pH值4～11的条件下菌落均能生长，生长最适宜pH值为8～9(见图2)。

注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著。图3、图4和图5同。图2 pH值对融安金桔新梢霉变致病菌Mucor sp.菌丝生长的影响

培养4 d，菌落在黑暗和连续光照下均可生长。黑暗下的菌落直径为34.69 mm，连续光照的菌落直径(15.66 mm)仅为黑暗下的45.14%，两者差异显著(p<0.05)。说明，连续光照对菌落生长有显著抑制作用。

培养4 d发现，菌落在8种碳源培养基上都能生长。以麦芽糖为碳源的菌落直径最大，其次是D-果糖和淀粉，直径分别为麦芽糖的87.78%和71.93%，相互间差异显著(p<0.05)。以山梨醇为碳源的生长速度较慢，菌落直径仅为麦芽糖培养基的43.41%。在无碳源培养基上，也能缓慢生长，菌落直径最小，仅为麦芽糖培养基的26.86%，说明菌株可利用其他物质来代替碳源(见图3)。

图3 碳源对融安金桔新梢霉变致病菌Mucor sp.菌丝生长的影响

培养4 d发现，在供试9种氮源培养基上，牛肉浸出膏培养基上的菌落直径最大，甘氨酸、尿素和精氨酸的菌落直径其次(分别为牛肉浸出膏培养基的83.72%、81.27%、78.95%)，苯丙氨酸的菌落直径再次(为牛肉浸出膏培养基的67.10%)。该菌株不能利用蛋白胨、硝酸钠和硝酸铵这3种氮源，说明菌株对不同氮源具有选择性。菌株在无氮培养基上也能生长，但菌落直径仅为牛肉浸出膏的24.40%，说明菌株也可利用其他物质来代替氮源(见图4)。

图4 氮源对融安金桔新梢霉变致病菌Mucor sp.菌丝生长的影响

2.3 咪鲜胺锰盐和硼酸室内抑菌效果培养4 d发现，与空白对照(0%)相比，0.10%和0.20%咪鲜胺锰盐均能显著抑制菌落的生长，且随着浓度增加抑制效果更加显著。与空白对照(0%)相比，0.05%硼酸显著促进了菌丝生长，说明低浓度硼酸对菌丝生长有着积极作用；当硼酸浓度增加到0.1%时，菌丝生长抑制率高达80.0%以上；当硼酸浓度达0.2%时，菌落无法生长(见图5)。可见，咪鲜胺锰盐和较高浓度硼酸能显著抑制菌丝生长，且抑菌效果随着浓度增加而增强；与咪鲜胺锰盐相比，硼酸的抑菌效果更好。

图5 不同浓度咪鲜胺锰盐和硼酸对融安金桔新梢霉变致病菌Mucor sp.菌丝生长的影响

2.4 硼酸处理对细胞膜透性的影响PI为膜非渗透性染料，在细胞膜受损时方可渗入细胞内，并嵌入DNA碱基对中与之结合发出荧光[16]。菌株分别接种在含0%(空白对照)和0.1%硼酸的PDA培养基上，培养4 d后，分别挑取菌落边缘的菌丝及孢子，经PI染色后进行观察。空白对照的菌丝着色较浅(图6)。0.1%硼酸处理的大多菌丝都被染成较深的红色(图6)，但孢子只有少量被染成红色。推测孢子的细胞膜结构更有利于抵抗硼酸的伤害作用，因此硼酸处理对菌丝细胞膜的完整性影响更大。

图6 硼酸处理对融安金桔新梢霉变致病菌Mucor sp.菌丝和孢子细胞膜透性的影响

3 讨论

本研究结果表明，经BLAST同源性比对，融安金桔新梢霉变致病菌与已报道的Mucorcircinelloides(登录号MH854658)的同源性为99%，再经形态学和系统发育树比较，判定融安金桔新梢霉变致病菌为毛霉属(Mucor)真菌。此菌引起的田间病害发生在春夏交接的温暖多雨季节，金桔新梢叶片容易出现霉变发黑症状，老叶和果实不感病，这与柑桔黑点病在老叶和果实上均能发生有明显不同[2]。在食品工业中利用毛霉含有高活性的蛋白酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等的特性，进行豆制品发酵和分解[17-18]。融安金桔新梢霉变致病菌毛霉菌株则可能利用其相关酶对新梢分解获得养分，从而达到侵染的目的，这与前人在果实腐烂和枯枝落叶中发现的毛霉具有相似的功能[19]。本试验表明，融安金桔新梢霉变致病菌毛霉菌株的最适生长温度是25 ℃，与融安春夏交接温暖多雨季节的温度条件相近，也与革莽枯萎病[20]、柑桔炭疽病、柑桔溃疡病等需要潮湿和温暖的环境才能快速地侵染幼叶、新梢和果实的结果相似[21]，还与前人研究发现的M.circinelloidesURM 4182的最大生物量和产油量的最适温度是26 ℃的结果相吻合[22]。融安金桔新梢霉变致病菌毛霉菌株在不同的pH值条件下均能生长，对pH值适应范围比较广，但以pH值8～9范围内生长最好，说明其较适宜生活于弱碱性环境。连续光照能抑制菌丝生长，因此在夏季，当地温度增高，光照变强时，新梢所发生的霉变也消失。该菌株能利用不同碳源和氮源，其中最适碳源为麦芽糖和D-果糖，最适宜氮源为牛肉浸出膏。该菌株对碳源的选择性不高，对氮源有明显的选择性，不能利用蛋白胨、硝酸钠和硝酸铵这3种氮源，其原因还有待于深入研究。

真菌细胞膜对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要作用。细胞膜脂质过氧化，膜结构遭到破坏，将引起细胞代谢紊乱，影响孢子萌发管的生长[23]。本试验表明，咪鲜胺锰盐和硼酸均能显著抑制菌丝生长，但以硼酸抑制效果最好。PI染色结果表明，细胞膜是硼酸的作用靶点，硼酸处理导致其细胞膜结构完整性破坏，引发细胞膜功能紊乱而导致细胞死亡，当菌株的细胞膜完整性降低，功能受损时，菌丝生长也受到抑制[24]。有研究发现，纳他霉素对柿饼中毛霉属抑菌效果好[25]，而戊唑醇对于浙江地区红花芍药中总状毛霉(Mucorracemosus)引起的病害杀菌效果佳[26]。说明，不同的毛霉种类对不同药剂的敏感性不同。室内抑菌试验表明，融安金桔新梢霉变致病菌毛霉菌株对咪鲜胺锰盐和硼酸均敏感，但田间药效还需验证。相比于咪鲜胺锰盐，硼酸还可作为叶面肥来促进花芽分化和花粉萌发，因此，尤其需对不同浓度硼酸的田间防治效果进行评价。