α粒子与酒精联合作用致肝细胞恶性转化的影响

刘红艳，王婧洁，张慧芳，党旭红，王 超，张忠新，张睿凤，原雅艺，任 越，董娟聪，柴栋良，李幼忱

中国辐射防护研究院，山西 太原 030006

随着我国核技术应用产业的发展，电离辐射对人类健康的影响越来越受到重视。α粒子由于具有较高的传能线密度(LET)，会导致较强的相对生物效应能(RBE)，它对人体健康的影响一直是职业健康中关注的重点[1-4]。超铀核素在核材料生产、MOX燃料制造、乏燃料后处理以及高放废物处理与处置中对人体健康存在潜在风险[5-6]。超铀核素半衰期长，比活度高，人体内负荷小，主要考虑通过吸入或从皮肤进入体内后产生的α粒子辐射能量沉积对组织器官的影响，肝脏是其重要的靶器官[7-8]。众所周知，肝脏是人体代谢的主要场所，且几乎是酒精代谢的唯一场所，涉核工作人员的饮酒习惯是否会增加α粒子内照射对人体的健康风险，目前没有足够的人群流行病学调查和实验动物、细胞水平的数据支持[9-12]。在α粒子内照射氡的健康评估中，已有流行病学研究表明氡与吸烟的联合致肺癌作用存在协同效应，与部分细胞学和动物学实验研究结果一致[13-16]。

因此本工作拟通过α粒子辐射体，建立体外细胞实验，开展α粒子辐射、酒精单独作用和两者联合作用肝细胞的实验研究，从细胞生物学、分子生物学水平探讨单因素、联合因素对人肝细胞生物学效应的影响，为系统评价α粒子内照射风险提供基础数据。

1 实验部分

1.1 实验细胞

LO2细胞是人正常肝上皮细胞构建成的永生化细胞系，购于中国科学院上海细胞库。

1.2 辐射源

苏州大学241Am α粒子辐射源装置，如图1所示，α粒子源几何尺寸为36 mm×4 mm，是有效直径为20 mm的面源，其活度为5.7×106Bq，文献[17]计算给出表面剂量率为0.138 Gy/min。面源与盖玻片盘平行放置，两者间距离为10 mm。

1.3 仪器和试剂

CO2细胞培养箱、酶标仪，Thermo 公司；超洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；实时荧光定量 PCR 扩增仪，Bio-Rad 公司；倒置相差显微镜，OLYMPUS公司；流式细胞仪，Beckman公司；高速冷冻离心机，Sigma公司。

RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和链霉素，上海生工；Trizol(主要成分为苯酚，含有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等抑制内源和外源RNA酶)、RNA 反转录、荧光定量PCR试剂盒，天根公司；细胞周期试剂盒、CCK-8试剂盒，凯基生物；酒精，分析纯，南京碧云天生物工程有限公司；Transwell板、Matrigel基质胶，美国康宁公司。

1.4 实验方法

1.4.1细胞培养 LO2人肝细胞在37 ℃恒温5%(体积分数)CO2环境下的细胞培养箱中，用含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，贴壁细胞生长至培养瓶底面积的80%～90%，经0.25%(质量分数)胰蛋白酶消化，进行1∶3传代，传代一次计1代(P1)，培养细胞瓶于倒置相差显微镜下观察细胞状态。

1.4.2细胞生长增殖检测 细胞生长增殖采用CCK-8试剂盒进行检测，已广泛应用于细胞毒理试验。首先制作人肝细胞生长标准曲线，取对数生长期细胞，用血球计数板计数细胞浓度，并将肝细胞密度分别调整为每毫升1万个、2万个、4万个、8万个、16万个，每孔分别接种100 μL于96孔板进行培养，每组设置5个复孔。待接种细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，37 ℃孵育3 h后，采用酶标仪于490 nm 波长处测量吸光度(OD)值。

1.4.3α粒子辐照剂量筛选 在文献[18-19]调研的基础上，初步确定了5个剂量点对肝细胞进行α辐照，剂量分别为0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy，根据辐照剂量=剂量率×辐照时间，α源的剂量率为0.138 Gy/min，计算出各实验点所需辐照时间分别为21.7、43.5、108.7、434.8、869.6 s，辐照前细胞接种于已消毒的玻片上，滤纸吸控细胞表面培养基，将贴有细胞的玻片面朝α源，置于α粒子辐射源装置辐照区卡槽内。辐照完成后，玻片直接放入培养基，待细胞继续生长数小时后进行消化转移至细胞培养瓶培养。对照组细胞同时置于玻片接受假辐照(0 Gy)，辐照后48 h进行细胞增殖活力检测，显微镜动态观察细胞形态和生长状况，筛选合适的辐照剂量进行后续α粒子辐照实验。

1.4.4酒精作用浓度筛选 在文献[20-22]调研的基础上，根据中国人群饮酒习惯，计算血液和肝脏代谢酒精浓度，初步采用酒精浓度(体积百分比)0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0% 和7.0%的细胞培养基进行肝细胞酒精作用24 h，结束后换成正常培养基，进行细胞增殖活力检测，显微镜动态观察细胞形态和生长状况，筛选合适的酒精浓度和作用时间进行后续酒精作用肝细胞实验。

1.4.5联合作用方式及实验分组 根据α粒子辐射和酒精单因素作用模型，建立复合作用方式。实验分为4组：对照组(不进行任何处理)；辐射组(单纯α粒子辐照)；酒精组(单纯酒精处理)；复合组(辐射组+酒精组，即细胞先经α粒子辐照后再经酒精作用处理)。实验用细胞经消化后进行传代，采用相同代数的各组细胞，且均处于40代以内，进行细胞生物学指标检测。

1.4.6细胞生物学效应

(1) 流式细胞术检测细胞周期

细胞周期是反映细胞生长增殖状态的重要指标之一。采用PI染料进行DNA染色，利用流式细胞术检测肝细胞周期。用Multicycle for windows 32-bit软件统计分析人肝细胞在G0/G1、S、G2/M这3个不同时期的细胞占比。每个实验样品设3个平行样，收集人肝细胞约1 × 106个，加入无水乙醇过夜固定肝细胞，用预冷的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline, PBS)清洗细胞去掉乙醇；加PI染料，室温避光孵育30 min后，用流式细胞仪进行定量检测。

(2) 细胞迁移和侵袭能力检测

细胞迁移和侵袭实验是反映细胞发生恶性转变的重要指标。采用Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力。细胞迁移检测：细胞接种于24孔板8 μm孔径滤膜的chamber上室，下室加入500 μL含胎牛血清培养基，避免起泡产生。每个实验组接种3个平行样，于37 ℃培养箱培养24 h后终止，用0.1%(质量分数)结晶紫染色，棉签擦去上室内膜上的细胞，将Transwell小室反过来底朝上，显微镜下观察小室底膜上附着细胞，随机选取5～10个视野，显微镜拍照，记录图像中细胞数量。检测细胞侵袭能力时，Transwell小室底部膜需要包埋 Matrigel基质胶，将冰上缓慢溶解的Matrigel基质胶与无血清培养基按体积比1∶8稀释后，加入小室底部，室温待其凝固，再接种细胞悬液，其余步骤与细胞迁移检测一致。采用Image J图像处理软件进行肝细胞数量自动计数。

(3) mRNA分子水平表达

采用实时荧光定量聚合酶链锁反应(Real-time qPCR)测定肝细胞恶性转化相关mRNA表达水平。在文献[23-25]调研的基础上，根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)DNA序列数据库GeneBank公布的序列，设计Real-time qPCR引物，结果列入表1。实验细胞待生长至80%～90%，用PBS冲洗3遍后，直接加入Trizol试剂，提取细胞总RNA，并逆转录成 cDNA，并以此为模板进行 Real-time qPCR 检测，每个样本设置3个重复样，结果采用ΔΔCT法进行分析。

表1 引物序列

1.5 统计学分析

2 结果和讨论

2.1 α粒子辐照剂量

LO2人正常肝细胞在含10%新生胎牛血清RPMI-1640培养基中正常生长，于倒置显微镜下观察细胞形态，呈上皮样、多角型，贴壁生长状态。采用241Am放射源对肝细胞进行不同剂量(0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy)α粒子辐照，辐照后48 h检测肝细胞存活分数，结果示于图2。由图2可知：与对照组(NC)比较，0.05 Gy组细胞活力差异不显著(P>0.05)；0.10、0.25、1.00 Gy组肝细胞的存活分数低于对照组，差异不显著(P>0.05)；2.00 Gy组肝细胞存活分数明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，肝细胞接受2.00 Gy辐照后，连续培养72 h，50%的细胞呈悬浮状态，出现明显死亡。因此，选择肝细胞存活分数几乎不受影响的1.00 Gy辐射剂量进行单因素α粒子辐照细胞，记为辐射组。

图2 不同剂量辐照48 h后对肝细胞存活分数的影响

2.2 酒精作用浓度

采用含酒精浓度(体积百分比)分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%的细胞培养基作用于肝细胞，与对照组比较，结果示于图3。由图3可知：酒精作用24 h后，0.5%和1.0%酒精作用组肝细胞存活分数低于对照组，但差异不显著(P>0.05)；2.0%和3.0%酒精作用组肝细胞存活分数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，在作用5 min后，长梭型贴壁细胞变圆，4 h 后形态恢复正常；4.0%～7.0%酒精作用组肝细胞存活分数显著低于对照组。因此，选择肝细胞存活分数几乎不受影响的1.0%酒精进行作用，记作酒精组。

图3 不同浓度酒精处理24 h后对肝细胞存活分数的影响

2.3 α粒子与酒精联合作用人肝细胞

在以上筛选的单因素辐射和酒精作用肝细胞模型的基础上，进行α粒子辐照和酒精联合作用，组成了复合作用方式：细胞先接受α粒子辐照后再经酒精作用。辐照剂量为1.00 Gy/次，累计辐照两次后经酒精作用，采用含1.0%酒精浓度的培养基培养，每代进行一次酒精处理，隔三天传代一次。

2.4 细胞生物学效应

2.4.1细胞周期 流式细胞术检测各实验组肝细胞周期示于图4。由图4可知：与对照组比较，辐射组S期细胞比例增加(P<0.05)、G2/M期细胞比例减少(P<0.05)，差异具有统计学意义；酒精组与复合组肝细胞处于G0/G1期的细胞比例均减少、S期细胞比例均增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)。辐射组与酒精组比较，G0/G1期细胞比例增加、S期和G2/M期细胞比例减少，差异均具有统计学意义(P<0.05)。复合组与辐射组比较，G0/G1期细胞比例减少、S期细胞比例增加，且有显著性差异(P<0.05)，各组的肝细胞周期百分比结果示于图5。由图5可知：辐射组细胞出现G0/G1期阻滞，DNA复制前的检查修复需要更长时间，与辐射致DNA损伤有关。与单因素组相比，复合组肝细胞G1期逃逸至S期，细胞周期失衡。

(a)——对照组，(b)——酒精组，(c)——辐射组，(d)——复合组

■——G0/G1，□——S，——G2/M

2.4.2细胞迁移和细胞侵袭 Transwell实验测定各实验组肝细胞发生迁移和侵袭的细胞数量示于图6。由图6可知：与对照组比较，辐射组、复合组肝细胞均发生了细胞迁移，差异有统计学意义(P<0.05)；与酒精组比较，辐射组发生迁移的细胞数量增加，差异有统计学意义(P<0.05)，复合组发生迁移和侵袭的细胞数量也均增加，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.001)；与辐射组比较，复合组发生侵袭的细胞数量增加，差异有统计学意义(P<0.05)，复合组发生侵袭的细胞数量最大，有着明显的恶性转化趋势，提示α粒子辐照后再进行酒精处理，酒精增加了肝细胞的侵袭能力，诱导细胞发生恶性转化。

(a)—(d)、(f)—(i)为显微镜成像图片

2.4.3分子生物学效应 用实时荧光定量聚合酶链锁反应(Real-time qPCR)的方法，检测与细胞恶性转化相关的抑癌基因p53和原癌基因mdm2、细胞粘附蛋白相关基因cdh1在mRNA水平的表达，结果示于图7。由图7可知：与对照组比较，单因素和复合组细胞p53基因和cdh1基因在mRNA水平表达降低，mdm2基因表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与酒精组比较，复合组肝细胞p53、cdh1和mdm2基因表达有显著差异(P<0.001)；与辐射组细胞比较，复合组细胞p53基因和mdm2基因表达有显著差异(P<0.05)，提示α粒子和酒精均诱导肝细胞发生恶性转化趋势，复合作用明显高于单因素作用，即辐照后酒精的作用促进了肝细胞原癌基因mdm2的高表达和抑制了抑癌基因P53的表达，从分子水平介导肝细胞发生恶性转化。

■——NC，——酒精组，□——辐射组，——复合组

3 结 论

研究发现α粒子辐射和酒精均能诱导肝细胞发生恶性转化趋势，复合因素作用下肝细胞原癌基因mdm2高表达，抑癌基因p53和细胞粘附相关基因cdh1低表达，发生明显的恶性转化趋势。提示α粒子辐照后再进行酒精作用的肝细胞发生恶性转化的风险增高，可能是酒精影响了肝细胞表面E型粘连蛋白的表达，导致细胞之间粘连性降低，促进细胞发生迁移和侵袭。因此，在评价α粒子内照射对健康的影响时需要考虑职业人员的饮酒习惯。