柴胡皂苷D对糖尿病视网膜病变大鼠的治疗作用△

司长峰 卜荔 徐楠 项燕 顾永昊

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)的一种常见微血管并发症，也是DM患者失明的最主要原因之一[1]。而目前对DR的防治效果并不理想，因此急需寻找或开发防治DR的新措施或新药物。

柴胡皂苷D(SSD)是从柴胡的干燥根中提取的类黄酮化合物，是柴胡的主要活性成分[2]。据报道，SSD具有包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗血管生成和保肝等多种药理活性[3-4]。在DR发病机制有关的因素中，氧化应激、慢性炎症和血管新生是DR发展的关键驱动因素[5-6]。基于SSD的药理活性以及DR进展的驱动因素，推测SSD可能具有抗DR进展的作用，而目前关于SSD对DR的治疗作用及其机制尚未完全清楚。因此，本研究通过对DR大鼠给予口服SSD来观察SSD是否可以减缓DR的进展，旨在为SSD防治DR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器SSD(纯度>98%)(南京道斯夫生物科技有限公司)，链脲佐菌素(STZ)、异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)(美国Sigma-Aldrich公司)，过碘酸雪夫(PAS)染色试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、组织裂解液和GAPDH抗体(上海碧云天生物技术有限公司)，Western blot 检测用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(H + L)二抗、血管内皮生长因子α(VEGF-α)抗体和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)，咬合蛋白(Occludin)抗体和闭锁小带蛋白1(ZO-1)抗体(美国 Zymed公司)，闭合蛋白5(Claudin-5)抗体和血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1) 抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)。血糖仪(德国Roche公司)，SynergyTMHT荧光计和Elx808酶标仪(美国Bio-Tek公司)，IX83荧光显微镜(日本Olympus公司)，Western blot电泳和电转系统、ChemiDoc XRS图像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与处理40只6周龄健康雄性SPF级无眼疾的SD大鼠(体重170～190 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，常规饲养于SPF级动物房。大鼠适应性饲养5 d后，随机分为正常对照(Con)组、DR组、低剂量SSD组和高剂量SSD组，每组纳入10只大鼠。其中，DR组、低剂量SSD组和高剂量SSD组大鼠首先参照文献[7]描述方法诱导大鼠DM模型，具体方法为：大鼠采用高脂高糖食物(含质量分数54.6%标准饲料、16.9%猪油、14.0%蔗糖、10.2%酪蛋白、2.1%预混料和2.2%麦芽糊精)持续喂养5周后，再连续3 d腹腔注射STZ(柠檬酸缓冲液配制，35 mg·kg-1·d-1)，在末次注射后第4天，用血糖仪测量大鼠尾静脉血糖水平，空腹血糖水平>300 dg·L-1的大鼠为DM大鼠；DM诱导完毕后，再持续喂养高脂高糖饮食12周以构建DR模型，并在持续高脂高糖喂养期间低剂量SSD组和高剂量SSD组分别给予口服低剂量(1 mg·kg-1·d-1)和高剂量(5 mg·kg-1·d-1)SSD。Con组大鼠采用标准饲料喂养5周，并腹腔注射与STZ等体积的柠檬酸缓冲液，然后继续采用标准饲料喂养12周。

1.2.2 视网膜微血管通透性评估在喂养方案结束时，每组随机选取5只大鼠戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，将含有50 g·L-1FITC-Dextran的生理盐水注射到左心室，灌注1 h后，用SynergyTMHT荧光计测量腹主动脉采集血样的荧光强度。随后立即摘除双眼眼球，用40 g·L-1多聚甲醛固定；并在解剖纤维镜下剪开角膜，剥离晶状体和玻璃体，用虹膜剪将视网膜上的色素上皮层剥离后，沿视网膜中心向边缘放射状切4刀，放置在显微镜载玻片上，荧光显微镜观察并拍照。每只大鼠任选4个视野的视网膜荧光图像，通过ImageJ软件检测其荧光强度，并以每只大鼠的血荧光强度对视网膜荧光强度进行标准化，获得各组大鼠血-视网膜屏障(BRB)的相对渗漏率。

1.2.3 视网膜收集用戊巴比妥钠麻醉每组剩余的5只大鼠，每只大鼠一眼分离的视网膜分别用于ELISA检测和Western blot检测；对侧眼参照文献[8]的方法用体积分数4%甲醛固定24 h后，再用视网膜胰蛋白酶消化以分离视网膜脉管系统用于PAS染色。

1.2.4 PAS染色取视网膜脉管系统行PAS染色，苏木精复染并封片后，显微镜白光视野下随机视野拍照。基于组织学特征，呈现鬼影细胞状态的周细胞被鉴定为周细胞丢失(PL)；没有周细胞或内皮细胞的毛细血管被认为是无细胞毛细血管(AC)。用ImageJ软件分析各组大鼠视网膜毛细血管网中AC和PL情况。

1.2.5 ELISA检测用组织裂解液裂解视网膜，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测组织裂解液中的蛋白质浓度，按照ELISA试剂盒说明书步骤，酶标仪检测裂解液中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.2.6 Western blot检测取蛋白定量后的视网膜裂解液，将含有等量蛋白质(30 mg)的组织裂解液行SDS-PAGE电泳，并经电转将蛋白转移到PVDF膜上。 用50 g·L-1脱脂奶粉封闭膜后，将膜与一抗[Occludin、Claudin-5、ZO-1 、VEGF-α、GFAP、VCAM-1抗体(均11000稀释)和GAPDH(110 000稀释)]4 ℃孵育过夜；第2天洗涤后，将膜与HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(12000)室温孵育1 h。再次洗涤后，用ECL 发光液显影，用ChemiDoc XRS图像系统拍摄蛋白条带，并以GAPDH为内参使用Quantity One软件分析条带相对光密度。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜微血管通透性比较FITC-Dextran染色结果显示，Con组大鼠视网膜微血管轮廓清晰可见；DR组大鼠视网膜在镜下呈现弥散荧光，微血管轮廓模糊不清；低剂量SSD组和高剂量SSD组大鼠视网膜中荧光强度较DR组降低，视网膜微血管轮廓部分可分辨(图1)。BRB定量结果显示，Con组、DR组、低剂量SSD组和高剂量SSD组大鼠的BRB相对渗漏率分别为(100.00±4.69)%、(223.47±5.12 )%、(181.72±6.13)%和(116.54±17.25)%；DR组大鼠BRB相对渗漏率较Con组明显增加，低剂量SSD组、高剂量SSD组大鼠BRB相对渗漏率均较DR组明显降低，且高剂量SSD组大鼠的BRB相对渗漏率较低剂量SSD组更低(均为P<0.05)。

图1 各组大鼠视网膜FITC-Dextran荧光图

2.2 各组大鼠视网膜毛细血管网中的AC和PL比较PAS染色结果(图2)显示，Con组大鼠视网膜毛细血管网显示正常，DR组和低剂量SSD组大鼠视网膜毛细血管网可见AC和PL改变；高剂量SSD组大鼠视网膜毛细血管网趋向正常。定量数据结果显示，DR组大鼠视网膜毛细血管网每视野下AC和PL的相对比例均较Con组明显增加，低剂量SSD组、高剂量SSD组大鼠视网膜毛细血管网每视野下AC和PL的相对比例均较DR组明显降低，且高剂量SSD组大鼠视网膜毛细血管网每视野下AC和PL的相对比例较低剂量SSD组更低(均为P<0.05)(表1)。

2.3 各组大鼠视网膜组织中促炎因子含量比较ELISA检测结果显示，与Con组比较，DR组大鼠视网膜组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均明显增加(均为P<0.05)；与DR组比较，低剂量SSD组、高剂量SSD组大鼠视网膜组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均明显降低(均为P<0.05)；且高剂量SSD组大鼠视网膜组织中上述因子含量均较低剂量SSD组更低(均为P<0.05)(表2)。

图2 PAS染色示各组大鼠视网膜毛细血管网(×200) 注：长尾箭头示AC，无尾箭头示PL。

表1 各组大鼠视网膜毛细血管网每视野下AC和PL的相对比例

表2 各组大鼠视网膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

2.4 各组大鼠视网膜组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白表达Western blot检测结果显示，与Con组比较，DR组大鼠视网膜组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白相对表达水平均明显降低(均为P<0.05)；与DR组比较，低剂量SSD组、高剂量SSD组大鼠视网膜组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白相对表达水平均明显升高(均为P<0.05)；且高剂量SSD组大鼠视网膜组织中上述蛋白相对表达水平均较低剂量SSD组更高(均为P<0.05)(图3和表3)。

2.5 各组大鼠视网膜组织中VEGF-α、GFAP和VCAM-1蛋白表达Western blot检测结果显示，与Con组比较，DR组大鼠视网膜组织中VEGF-α、GFAP和VCAM-1蛋白相对表达水平均明显升高(均为P<0.05)；与DR组比较，低剂量SSD组、高剂量SSD组大鼠视网膜组织中的VEGF-α、GFAP和VCAM-1蛋白相对表达水平均明显降低(均为P<0.05)；且高剂量SSD组中上述蛋白相对表达水平均较低剂量SSD组更低(均为P<0.05)(图4和表4)。

图3 Western blot检测各组大鼠视网膜组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白表达

表3 各组大鼠视网膜组织中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白相对表达水平

图4 Western blot检测各组大鼠视网膜组织中VEGF-α、GFAP和VCAM-1蛋白的表达

表4 各组大鼠视网膜组织中VEGF-α、GFAP和VCAM-1蛋白相对表达水平

3 讨论

目前全球约有4亿DM患者[9]，其中超过1/3的DM患者合并有DR[10]，随着DM患者数量的逐年增多，DR的发病率也呈逐年增高趋势[11]。目前，临床常用的药物仅显示出一定的临床效果，但并不能完全控制DR进程[12]；眼科手术也不能彻底恢复患者视功能，且手术还具有造成角膜瘢痕形成和眼内感染的风险[13]。据报道[14-15]，天然生药来源的某些化合物具有优良的抗炎、抗氧化和抗血管生成的作用，提示这些化合物中可能会筛选出优良的抗DR药物。本研究结果显示，SSD能减轻DM大鼠视网膜微血管炎症和BRB渗漏，提示SSD可能是潜在的抗DR药物。

DM患者的持续高血糖会引起视网膜微血管内皮细胞障碍和BRB障碍，进而导致DR的发生，且BRB障碍能进一步引起DR患者的黄斑水肿、视网膜出血甚至脱落[16]。因此，改善BRB障碍能减缓甚至抑制DR进展。本研究结果显示，SSD能减轻DR大鼠视网膜病变程度(AC和PL均较DR组大鼠减少)和抑制BRB渗漏。BRB的作用效果取决于视网膜微血管内皮细胞中紧密连接蛋白的表达和分布[17]。ZO-1、Occludin 和Claudin-5等紧密连接蛋白表达水平的降低会加剧DR患者的视网膜微血管渗透性和BRB障碍，而上调其表达可恢复BRB功能和降低视网膜微血管渗透性[17]。本研究结果显示，SSD能促进DR大鼠视网膜中ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，提示SSD能通过促进紧密连接蛋白表达来改善DR所致的BRB障碍，降低视网膜微血管渗透性。

视网膜微血管的慢性炎症反应不仅是DR的主要诱因，还是整个DR进展过程中的主要驱动因素，抑制炎症反应能延缓DR的进展[5,18]。长期高血糖能诱导视网膜微血管内皮细胞分泌过量的促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β等)，且这些促炎因子能通过细胞间黏附因子-1(ICAM-1)和VCAM-1等进一步招募单核细胞聚集来加剧视网膜微血管炎症反应，进一步引起视网膜微血管通透性增加和BRB障碍，最终致视网膜脱落[18-19]。因此，抑制视网膜微血管炎症反应是减缓DR进展的关键步骤之一。本研究结果显示，SSD能抑制DR大鼠视网膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平和黏附因子VCAM-1的表达，提示SSD能抑制DR所致的视网膜微血管炎症。

在视网膜中，GFAP主要定位于Müller细胞。长期高血糖能诱导GFAP表达增加，促使Müller细胞活化增生，而活化的Müller细胞不仅能促使兴奋性谷氨酸在视网膜中聚集[20]，还能分泌VEGF、碱性成纤维细胞生长因子和干扰素-α等细胞因子，引起视网膜微血管内皮细胞功能障碍和紧密连接蛋白表达水平降低，导致BRB障碍和视网膜微血管通透性增加[21-22]。VEGF-α表达增加不仅能导致视网膜微血管内皮细胞中紧密连接蛋白表达水平降低，导致BRB障碍[23]；还能导致ICAM-1和VCAM-1表达升高，启动视网膜微血管内皮与单核细胞黏附，形成白细胞栓子，加重视网膜微血管炎症反应、BRB障碍和缺氧环境，进而促进新生视网膜微血管形成，促使DR进入增生期[24-25]。此外，高血糖诱导的促炎因子能通过上调GFAP和VEGF-α的表达导致视网膜微血管通透性增加[26]。本研究结果显示，SSD能抑制DR大鼠视网膜组织中VEGF-α和GFAP的表达。

综上所述，SSD可能通过减轻视网膜微血管炎症和渗透性来改善DR大鼠的视网膜病变，提示SSD可能是潜在的抗DR药物。