白藜芦醇对碱烧伤小鼠角膜纤维化反应的抑制作用△

张欢 姜志昕 周永莹 曹秀朋 王玉川 李轩

眼部化学烧伤占眼部损伤的11.5%～22.1%[1]，其中，碱烧伤比酸烧伤发生得更为频繁[2]，并导致更为严重的组织损伤。碱可导致组织皂化，并快速渗透到深部组织，受损组织发生液化性坏死，引起炎症反应，释放出大量蛋白水解酶，进一步损害组织[3-5]。角膜混浊是角膜碱烧伤的主要并发症之一，也是导致角膜失明的主要原因。目前，类固醇皮质激素和胶原酶抑制剂主要用于保持角膜透明度并促进碱烧伤后的伤口愈合[6]。尽管取得了显著进展， 但在预防角膜碱烧伤引起的角膜损伤方面并没有达到预期效果[7]。角膜碱烧伤的治疗仍然是眼科医生面临的主要挑战[3]。白藜芦醇(RSV)是一种多酚类抗毒素，存在于葡萄、虎杖等天然植物中，具有抗炎、抗氧化、抑制纤维化、延缓衰老等重要的药理活性[8]。研究证实，RSV能显著抑制化学药物损伤引起的肺、肝脏等重要器官的纤维化反应[9-10]。然而，RSV对角膜碱烧伤引起的组织纤维化反应是否有保护作用，目前尚未见报道。本研究探讨RSV对碱烧伤小鼠角膜纤维化的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级、健康6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠48只，体重(20.0±1.20)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养于中国科学院放射医学研究所动物中心，室内温度(22±2)℃、相对湿度40%～60%，12 h/12 h照明昼夜循环。

1.1.2 主要试剂及仪器RSV(Sigma公司，美国)，滤纸片(杭州富阳北木浆纸有限公司)，妥布霉素滴眼液、眼膏，盐酸丙美卡因滴眼液(Alcon公司，比利时)，羟丙基-β-环糊精(Solarbio公司)，抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(Proteintech，美国)，抗Ⅲ型胶原纤维蛋白α1链(COL3A1)抗体、抗转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(Santa Cruz公司，美国)，数码裂隙灯显微镜(苏州微清医疗有限公司)，体式显微镜(Zeiss公司，德国)，激光共聚焦荧光显微镜(Leica，德国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理裂隙灯显微镜下检查小鼠角膜，均为正常。采用随机数字表法将48只雄性C57BL/6J小鼠分为正常对照组、模型组和RSV组，每组16只。模型组和RSV组小鼠右眼建立角膜碱烧伤模型，左眼不做任何处理，造模后每间隔8 h分别用5 μL羟丙基-β-环糊精溶液或2 g·L-1RSV溶液滴眼，连续滴眼21 d。用药浓度和频次参照文献[11-12]。正常对照组不做造模和滴眼处理。本实验遵循《实验动物管理条例》。

1.2.2 RSV溶液的制备RSV难溶于水；羟丙基-β-环糊精作为一种具有良好生物耐受性的包合物，可显著增加RSV的水溶性和稳定性[13]，并已在滴眼液配方中进行临床评估[14-15]。参照文献[16]，在0.03 mol·L-1羟丙基-β-环糊精溶液中制备2 g·L-1RSV溶液。整个过程在暗室中完成，并用铝箔纸包裹试管，防止光诱导RSV变性。

1.2.3 小鼠角膜碱烧伤模型的制作将小鼠按照10 mL·kg-1腹腔注射50 g·L-1水合氯醛进行全身麻醉，盐酸丙美卡因滴眼液滴于右眼，进行眼表麻醉。参照文献[17]构建角膜碱烧伤模型，具体步骤如下：将浸泡于1 mol·L-1NaOH、直径2 mm的圆形滤纸片置于小鼠右眼角膜中央10 s，同时注意不损伤角膜缘、眼睑及结膜。术后用20 mL生理盐水冲洗眼表及结膜囊，妥布霉素滴眼液滴眼或眼膏涂眼预防感染。排除后期角膜感染，32只小鼠均造模成功。

1.2.4 角膜混浊评分参照文献[18]，由两名研究人员单独对角膜混浊程度进行评分。采用0～4分制进行评分，评分标准：0分为角膜完全透明，虹膜及瞳孔清晰可见；1分为角膜轻微不透明，可见虹膜和瞳孔细节；2分为角膜轻度模糊，隐约可见虹膜和瞳孔；3分为角膜不透明，几乎不可见虹膜和瞳孔；4分为角膜完全不透明，不可见虹膜和瞳孔。

1.2.5 组织病理学观察各组小鼠角膜组织中α-SMA及COL3A1蛋白的表达角膜碱烧伤后21 d，全身麻醉后颈椎脱臼法处死各组小鼠，完整取下眼球，放入40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定过夜，按标准流程脱水处理，进行石蜡切片。HE染色观察各组小鼠角膜组织结构，免疫荧光染色观察各组小鼠角膜组织中α-SMA及COL3A1抗原蛋白的表达情况。

1.2.6 Western blot检测各组小鼠角膜组织中TGF-β1、α-SMA及COL3A1蛋白的表达角膜碱烧伤后21 d，全身麻醉后颈椎脱臼法处死各组小鼠，完整取下角膜，提取角膜组织蛋白样品。蛋白样品电泳在100 g·L-1十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后在220 mA时转移至PVDF膜。膜用50 g·L-1脱脂牛奶室温下孵育2 h后，用一抗抗TGF-β1(1500稀释)、抗α-SMA(1600稀释)、抗COL3A1(11000稀释)、GAPDH(11000稀释)4 ℃孵育过夜。第2天室温下孵育荧光二抗(115 000稀释) 2 h。用奥德赛萨双色红外激光成像系统曝光(Licor，美国)，用ImageJ软件分析条带灰度值。以GAPDH为内参，计算不同目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计学软件分析数据，服从正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t检验对数据进行统计分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠角膜混浊及混浊程度评分角膜碱烧伤后21 d，裂隙灯显微镜观察各组小鼠角膜混浊程度发现：正常对照组小鼠角膜完全透明，虹膜及瞳孔清晰可见，模型组小鼠角膜中重度混浊，几乎不可见瞳孔和虹膜，RSV组小鼠角膜轻度混浊，可透见瞳孔及虹膜(图1)。RSV组小鼠角膜混浊评分[(2.25±0.89)分]明显低于模型组[(3.25±0.71)分]，差异有统计学意义(P=0.026)。

图1 各组小鼠角膜混浊情况

2.2 各组小鼠角膜组织的HE染色结果HE染色结果显示，正常对照组小鼠角膜结构完整，上皮细胞3～4层，基质胶原排列规则；角膜碱烧伤后21 d，模型组和RSV组小鼠角膜上皮细胞均为2～3层，上皮细胞排列欠规则，角膜基质水肿，但模型组小鼠角膜基质中细胞数较RSV组增多(图2)。

图2 各组小鼠角膜组织HE染色结果

2.3 各组小鼠角膜组织中α-SMA与 COL3A1的表达免疫荧光染色结果显示，正常对照组小鼠角膜基质细胞不表达α-SMA蛋白，角膜基质不表达COL3A1。角膜碱烧伤后 21 d，模型组小鼠角膜基质细胞α-SMA染色呈强阳性，角膜基质中表达COL3A1；RSV组小鼠角膜基质细胞α-SMA和角膜基质中COL3A1表达均弱于模型组(图3)。

图3 各组小鼠角膜组织中α-SMA和COL3A1的免疫荧光染色结果 注：α-SMA(绿色荧光)，COL3A1(红色荧光)；箭头示阳性染色。

2.4 Western blot检测各组小鼠角膜中TGF-β1、α-SMA及 COL3A1蛋白的表达Western blot检测结果显示，正常对照组小鼠角膜几乎不表达TGF-β1、α-SMA、COL3A1；角膜碱烧伤21 d后，模型组小鼠角膜组织中TGF-β1、α-SMA、COL3A1的蛋白相对表达水平分别为1.48±0.50、0.55±0.18、1.32±0.87，显著高于RSV组[TGF-β1(0.60±0.17)、α-SMA(0.27±0.05)、COL3A1(0.49±0.21)]，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4)。

图4 Western blot检测各组小鼠角膜组织中TGF-β1、α-SMA及COL3A1蛋白的表达

3 讨论

伤口愈合是一个严格控制的过程，它的失调可能导致纤维化、瘢痕和组织功能丧失。角膜碱烧伤是临床上常见的难治性眼病之一，严重损伤眼部组织。对角膜损伤的纤维化反应通常造成严重的角膜混浊，进而导致视力下降甚至失明。肌成纤维细胞形成和组织纤维化都参与碱烧伤后角膜的伤口愈合过程或角膜混浊的形成[19-20]。因此，抑制该过程全部或部分环节可以减轻角膜的混浊。

RSV是一种天然多酚类物质，在不同的组织器官和细胞中具有调节纤维化反应的功能[8]。Wang等[10]研究证实，RSV能显著逆转博来霉素诱导的肺纤维化。Bai等[21]报道，RSV可抑制肾小管上皮细胞上皮间质转化和肾纤维化。Zhu等[9]报道，RSV通过增加自噬抑制四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。然而，RSV在角膜组织纤维化中的保护作用尚不清楚。本研究建立小鼠角膜碱烧伤模型，用以评价RSV对碱烧伤小鼠诱导角膜纤维化的保护作用。

角膜的透明性对其正常功能十分重要。研究表明，纤维细胞参与角膜伤口愈合，以应对可能导致基质纤维化的损伤[22]。然而在异常的愈合反应中，角膜基质细胞转化为肌成纤维细胞并发生纤维化反应，导致角膜透明度的丧失[23]。 α-SMA是纤维细胞活化为肌成纤维细胞的标志。在本研究中，免疫荧光染色和Western blot检测结果均显示，碱烧伤使小鼠角膜组织中α-SMA表达增加，给予RSV干预后，α-SMA表达显著下降，表明碱烧伤诱导角膜基质细胞活化为肌成纤维细胞，RSV可抑制肌成纤维细胞的活化，这与Yi等[24]研究多西环素促进碱烧伤角膜伤口愈合的结果部分一致。与角膜组织中其他类型的胶原类型相比，Ⅲ型胶原纤维在新生儿角膜和成人角膜的瘢痕组织中都有发现[25]。在受伤的角膜中，肌成纤维细胞过量表达COL3A1，导致Ⅲ型胶原纤维蛋白显著沉积在愈合的基质和瘢痕组织中[26-27]。在本研究中，碱烧伤后21 d，模型组小鼠角膜组织中COL3A1蛋白表达显著增高，RSV组小鼠角膜组织中COL3A1蛋白表达显著下降，表明RSV可减少损伤角膜组织中异常胶原纤维的沉积，这与Joung等[28]研究SP-8356抑制分化簇147减轻角膜混浊的结果一致。肌成纤维细胞活化和异常胶原纤维沉积是造成角膜混浊的主要原因[24]，RSV这种抑制纤维化的作用与显微镜下观察角膜混浊程度的结果一致。

研究表明，角膜损伤后TGF-β1的合成增加与角膜纤维化的发展有关；在角膜损伤后，伤口附近的上皮细胞、角膜细胞、内皮细胞产生大量TGF-β1，持续暴露于TGF-β1环境下会促进角膜成纤维细胞增殖，肌成纤维细胞转化加速和紊乱的细胞外基质产生[29-31]。本研究中，碱烧伤后模型组小鼠角膜组织中TGF-β1表达显著增加，而RSV组小鼠角膜组织中TGF-β1表达较模型组明显下降，这与α-SMA、COL3A1的免疫荧光染色和 Western blot检测结果趋势一致。说明RSV能抑制损伤角膜组织中TGF-β1的表达和角膜纤维化。

综上所述，本研究通过RSV局部滴眼的方式观察碱烧伤后小鼠角膜混浊程度变化及角膜组织内TGF-β1、α-SMA和COL3A1的表达情况，结果证实，RSV可以抑制碱烧伤诱导的角膜纤维化反应，从而改善角膜混浊程度。这表明RSV可能是治疗病理性角膜纤维化潜在的药物，但其具体作用机制尚不明确。我们将在下一步实验中探索RSV在受损角膜中抗纤维化作用的详细潜在机制。