microRNA-34a与乳腺癌的临床病理相关性研究

赵艳丽，刘 钊，张家新，王人颢，刘志毅，田子路，刘 斌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，到2030年，我国的女性乳腺癌发病人数预计达到23.4万，而因患乳腺癌致死的人数将达到7万人以上[1]。据2019年美国癌症协会的最新报道称，乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率仍为最高[2]，因此，对于寻找乳腺癌的特异分子指标尤为重要。microRNA(miRNA)主要通过与靶基因结合抑制其表达，进而参与调节细胞的增殖及迁移侵袭能力[3]，由此miRNA受到人们的关注，同时也是对miRNA功能深入研究的开端[4-5]。目前在几乎所有恶性肿瘤中都发现miRNA的表达异常，认为其在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色[6]。miR-34基因最早被发现于秀丽隐杆线虫中[7]，miR-34a可以靶向和调节Fra-1、LMTK3、Bcl-2、Notch等许多乳腺癌病人体内的基因，提示miR-34a与乳腺癌的发病机制可能有关，miR-34a的失活或缺失可能与肿瘤的发生有关。因此，研究miR-34a在乳腺癌中的表达及其与临床病理的关系，可以进一步探讨其临床意义，为乳腺癌的预后及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 确诊为乳腺癌并实施手术治疗的67例病人的标本组织，其中非浸润性癌5例、浸润性癌61例和特殊类型癌1例；根据2017年美国癌症联合委员会(AJCC)第8版癌症分期系统TNM 分期标准，临床分期分为Ⅰ期24例，Ⅱ期32例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。

1.2 技术路线 以确诊为乳腺癌的67例病人的癌组织和癌旁正常组织标本为研究对象，应用qRT-PCR检测miR-34a的表达，最后检测miR-34a与乳腺癌临床病理参数的相关性。

1.3 标本收集 根据术前彩超结果，疑似乳腺癌者，取肿瘤组织以及相应的距肿瘤边缘5 cm以上的正常组织，放存液氮中，病理结果确诊后，舍弃不能入组者，入组标本置入-80 ℃冰箱冻存，同时记录临床资料备病理査询和后续统计分析。入组标准：(1)手术病理明确诊断为乳腺癌；(2)临床病理资料完整；(3)未合并其他恶性肿瘤；(4)术前未行新辅助化疗、放疗、内分泌及靶向治疗。排除标准：(1)手术病理非乳腺癌；(2)临床病理资料不完整；(3)术前已经行新辅助化疗、放疗、内分泌及靶向治疗。

1.4 方法 Trizol一步法提取RNA，用紫外线分光光度计测量RNA的纯度，采取纯度比率在1.8～2.0之间的样本进行逆转录反应、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。U6作为内参对照，ΔCt=Ct(miR-34a)-Ct(U6)，ΔΔCt=ΔCt(乳腺癌)-ΔCt(正常组织),利用公式F=2-ΔΔCt计算得出组织中miR-34a的差异倍数。

三阴性乳腺癌判断标准：根据免疫组织化学的结果，癌组织免疫组织化学检查结果中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体(HER-2)均呈阴性的乳腺癌，其中HER-2阳性定义为免疫组织化学结果为3+或ISH检测阳性。

1.5 统计学方法 采用Mann-WhitneyU检验、Kruskal-WallisH检验和配对设计的Wilcoxon符号秩和检验。

2 结果

2.1 乳腺组织中miR-34a的表达 比较2-△Ct癌和2-△Ct正常组织，其中ΔCt癌=[Ct(miR-34a)-Ct(U6snRNA)]癌，ΔCt正常组织=[(Ct(miR-34a)-Ct(U6snRNA)]正常组织，癌组织的中位数0.042，四分位间距0.024～0.095；正常组织的中位数为0.114，四分位间距0.058～0.155；乳腺癌组织中的miR-34a的表达量明显低于相应正常组织中的表达量(t=4.26，P<0.01)。

2.2 miR-34a的表达与临床病理联系 年龄、性别、月经状况、PR水平、Ki67表达与HER-2水平对病人癌组织miR-34a的表达影响均无统计学意义(P>0.05);肿块直径、淋巴结转移、病理类型、临床分期、ER水平、是否三阴性对对病人癌组织miR-34a的表达影响均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)，肿块直径≤2 cm组的表达高于直径>2 cm组(P<0.05)，淋巴结无转移组的表达高于有转移组(P<0.05)，非浸润性组的表达高于浸润性(P<0.05)，Ⅰ期和Ⅱ期组的表达均高于Ⅲ+Ⅳ期组(P<0.01)，ER阳性组的表达高于阴性(P<0.01)，三阴性组的表达低于非三阴性组(P<0.01)(见表1)。

表1 miR-34a 表达与乳腺癌临床病理参数之间关系[M，(P25～P75)]

续表1

3 讨论

乳腺癌早期多表现为乳房肿块、乳头和乳晕改变，晚期癌细胞可发生远处转移，引起多器官病变，严重危害病人的身心健康，因此深入研究乳腺癌的分子机制，找到有效的检测指标，为治疗提供依据，可以延缓病人的生命甚至达到治愈。近年随着分子生物学研究的深入，越来越多的与肿瘤发生发展相关的信号分子被发现，研究报道几种特定的 miRNA可以作为潜在的预测性生物标志物[8]。肿瘤抑制因子p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，因此也一直作为研制抗癌药的靶点[9]，肿瘤抑制因子p53可以直接调控miR-34a[10]，并且研究证明miR-34a是可以通过靶向调节与细胞周期停滞和凋亡相关的一系列基因，在决定细胞命运中起关键作用[11]。因此，miR-34a可以作为一种新的生物指标，为乳腺癌在临床中的诊断及治疗进提供依据。

本研究中，miR-34a的表达与肿瘤病理分型、直径、淋巴结转移、TNM分期、ER及三阴性表达有关(P<0.05～P<0.01)，表明miR-34a的表达与乳腺癌的发生、发展及预后有关，并且可作为一种新的生物标志物，为乳腺癌的治疗提供新的方案和依据，甚至是靶向治疗提供分子基础。miR-34a在男、女中表达出现明显差异，但由于病例数少，差异无统计学意义，但可为后续实验提供实验思路，分析男性、女性乳腺癌病人中miR-34的表达情况，从而找出性别中表达差异，为乳腺癌的预防和治疗提供帮助。