56 ℃加热30 min灭活病毒对血清酶学项目检测结果的影响

尹笑笑 李欢 纵如原 刘倩 杨伏猛

江苏省连云港市第二人民医院检验科 222006

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）通过入侵人体呼吸道，导致患者出现不同程度的呼吸道疾病，其引起的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease，COVID-19）严重危害了人类的身体健康［1-2］。有研究报道：SARS-CoV-2 可通过呼吸道飞沫、密切接触以及气溶胶传播，故在一定程度上给实验室操作人员造成了潜在暴露的风险［3-5］。但由于该病毒具有不耐热的生物学特性，可通过56°C 加热30 min 将其灭活，故为了降低实验室操作人员在检测COVID-19 患者的标本时造成感染的风险，急需采取切实可行的预防措施［6-7］。本研究通过模拟SARS-CoV-2 的灭活条件，基于56 °C 加热30 min 的方式对血清标本采取灭活处理，并比较灭活前、灭活后血清酶学检测结果是否有差异，旨在为实验室通过加热灭活病毒开展血清酶学的检测提供潜在的理论支撑。

1 资料与方法

1.1 研究对象 采用完全随机化原则选取2021 年1 月于连云港市第二人民医院体检中心体检者50 例作为研究对象，其中男性28 例、女性22 例，年龄（43.2±9.5）岁。纳入标准：⑴年龄分布在20～60 岁之间；⑵血压、血糖、血脂正常；⑶血清常规生化指标在正常参考区间内；⑷无吸烟、熬夜、酗酒等不良生活习惯；⑸近半年无手术治疗史；⑹近1 个月无药物治疗史。排除标准：⑴排除输血4 项阳性患者（乙肝、艾滋、梅毒、丙肝）；⑵排除肝功能、肾功能、心功能异常者；⑶排除肿瘤、血液病等恶性消耗性疾病；⑷排除感染其他类型病毒的患者。

该研究经连云港市第二人民医院医学伦理委员会审核通过（2020X021），且所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 样本采集与处理 告知受检者采血前注意事项：饮食清淡合理，采血前禁食8～12 h。清晨空腹状态下静坐数分钟后采集静脉血5 ml（黄色含分离胶管），标本静置15 min 后4 000 r/min 离心10 min，离心半径10 cm。应用配对设计试验将离心后的血清分为相同的两组，一组（50 份）作为灭活前样本，另一组（50 份）放入电热恒温箱56 ℃加热30 min，待冷却至室温后，4 h内完成两组标本血清酶学项目的检测。

1.3 实验器材 ⑴仪器：产自美国贝克曼公司的AU5800 全自动生化分析仪；电热恒温培养箱HT-400B（金坛区金城春兰实验仪器厂）；医用低速离心机BY-320A（北京白洋医疗器械有限公司）。⑵试剂：美国贝克曼公司的淀粉 酶（amylase，AMY）、丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenation enzyme，LDH）测定试剂盒，批号分别为AUZ7420、AUZ7654、AUZ6899、AUZ7859、AUZ7945、AUZ7046；北京利德曼生化股份有限公司生产的腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）、α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）测定试剂盒，批号分别为20061902、19122511；美国贝克曼公司的混合血清质控品，批号为M901102、M901103。样本上机检测前，检测系统均处于就绪状态，且当日酶学项目室内质控均在控，分析性能满足要求。

1.4 检测方法 本研究各项目检测的方法：⑴AMY 检测基于PNP-G7 底物法；⑵ALT 检测基于乳酸脱氢酶法；⑶AST 检测基于苹果酸脱氢酶法；⑷ALP 检测基于速率法；⑸GGT检测基于速率法；⑹LDH检测基于乳酸底物法；⑺ADA检测基于过氧化物酶法；⑻AFU检测基于速率法。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0 软件进行统计学处理。运用Kolmogorov-Smirnov 检验进行数据的正态性检验。正态分布的计量资料以（±s）表示，采用配对t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较选用Wilcoxon 秩和检验；采用Bland-Altman 图进行一致性分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.6 结果评价 评价56 ℃加热30 min 灭活病毒对酶学项目是否有影响的标准。⑴比较热灭活前后检测结果，当P＜0.05 时，差异有统计学意义，认为灭活对相关指标有影响。⑵血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA 采用国家卫生健康委员会临床检验中心室间质评提供的允许总误差（allowable total error，TEa）［8］：灭活前与灭活后检测结果的最大允许偏差≤1/3TEa，若灭活前后有20%的检测结果大于最大允许偏差，认为灭活对酶学相关指标有影响；血清AFU的TEa来源于试剂说明书。

2 结 果

2.1 56 ℃加热30 min 灭活对血清酶学项目指标的影响 本研究显示：血清AMY 灭活前与灭活后差异无统计学意义（P＞0.05），故56 ℃加热30 min 的标本处理方式对AMY 的检测无显著影响；而血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU灭活前与灭活后差异有统计学意义（均P＜0.05），且灭活后各项目的检测结果显著低于灭活前。见表1。

表1 50例体检者56 ℃加热30 min灭活前后血清AMY、ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU比较（U/L）

2.2 56 ℃加热30 min 灭活前后一致性分析 由于血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU 这7 个项目灭活前后检测结果差异有统计学意义（均P＜0.05），因此本研究应用Bland-Altman 图进行临床可接受的一致性判断，结果显示：血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA、AFU 项目在灭活前与灭活后结果差值最大点的偏倚分别为54.05%、16.67%、94.74%、20.00%、23.67%、73.33%、391.75%，均超出其1/3TEa（ALT=5.33%，AST=5.00%，ALP=6.00%，GGT=3.67%，LDH=3.67%，ADA=8.33%，AFU=6.00%），且超出临床可接受范围的结果数量均大于20.00%，故上述7 项酶学项目的检测结果在灭活前后不具有一致性。见图1。

图1 50例体检者血清样本热灭活前后Bland-Altman一致性分析。A为ALT热灭活前后Bland-Altman一致性分析，B为AST热灭活前后Bland-Altman一致性分析，C为ALP热灭活前后Bland-Altman一致性分析，D为GGT热灭活前后Bland-Altman一致性分析，E为LDH热灭活前后Bland-Altman一致性分析，F为ADA热灭活前后Bland-Altman一致性分析，G为AFU热灭活前后Bland-Altman一致性分析

3 讨 论

实验室血清学指标的检测在COVID-19 的诊断、治疗效果监测、预后评估等方面发挥了至关重要的临床作用［9-11］。《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中明确指出，未经灭活处理的COVID-19 患者的血液标本需在具备二级生物安全的实验室进行操作，且操作人员应严格采取三级防护措施，以减少病毒在实验室内扩散或感染的风险［12］。但由于实验室条件所限，即不具备专职人员处理COVID-19患者的标本及专用检测设备，故实验室人员在操作过程中存在潜在感染的风险。 因此，如果对COVID-19 患者的标本采取病毒灭活（56 ℃加热30 min）处理后再行检测，则可以避免实验室人员职业暴露的潜在风险。

依据纳入标准和排除标准，本研究将50 例符合要求的健康体检者纳为研究对象，并模拟了SARS-CoV-2 的灭活条件（56 ℃加热30 min），对灭活前、灭活后血清标本的酶学项目的检测结果进行了统计分析，结果显示：热灭活标本的处理方式对血清ALT、AST、ALP、GGT、LDH、ADA 和AFU 这7 个项目的检测结果具有显著影响，仅血清AMY 的检测结果不受影响。此外，笔者又应用Bland-Altman 图对差异有统计学意义的7 个项目进行了临床可接受性的评价，且研究结果再次显示：56 ℃加热30 min 的灭活处理对血清酶检测的影响超出了临床可接受范围，其灭活前后结果不具有一致性。刘兆宇等［13］对临床常用生化指标和炎症指标进行灭活前后的研究，其研究结果表明：ALT、ALP、GGT 的检测结果受灭活条件的显著影响，AMY 虽受灭活影响，但经回归方程校正后，仍对临床诊断有参考价值，该结论与本研究结果一致。刘长德等［14］针对样本灭活前后38 项生化指标检验结果进行研究，其研究结果表明：LDH、AST 热灭活前后的结果差异均无统计学意义（均P＞0.05），但大于20%的数据超出TEa，该结论与本研究相对一致。郭旺源等［15］在研究热灭活对免疫球蛋白M 抗体和生化免疫检测项目结果的影响时发现：ALT、LDH、ALP、GGT 等对热敏感的酶学项目的检测结果受灭活条件的影响大，而AST 灭活前后结果差异无统计学意义（P＞0.05），其结论与本研究存在一定差异。Pan 等［16］应用加热灭活方式对COVID-19 患者的咽拭子和痰液标本处理后进行SARS-CoV-2 核酸检测，其结果显示：56 ℃加热30 min的灭活方式严重降低了其检测效能，甚至导致了假阴性的出现。基于上述报道和本研究结果存在的差异，笔者推测其原因可能为：⑴由于选择的研究对象不同，其体内各项指标的基线水平存在潜在的不同所致；⑵酶的催化活性受多种因素影响，且不同的检测系统，其检测方法可能不同，进而导致检测结果存在差异。

本研究也存在一定的局限性：⑴由于本研究所纳入的对象为20～60岁健康成人，并非感染SARS-CoV-2的人群，故无法确定含有SARS-CoV-2 的血清对酶学项目是否存在一定的影响；⑵本研究所纳入的研究例数相对较少，为得出更具代表性的结果，需进一步扩大样本量。

总之，本研究认为56 ℃30 min 热灭活的条件对血清酶学检测结果具有潜在的影响。因此，笔者建议实验室采用该条件处理临床样本时，需采取必要的措施以校正实验数据，进而为临床提供精准的检测结果。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。