miR-6886-5p通过调控LASP1表达抑制胃癌细胞的增殖和迁移

汤守元 兰国玉 黄耿 朱钟钟 李新明 罗海平 姜进平

1 鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）胃肠肛肠外科，湖北435000；2 鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科，湖北435000

胃癌是消化道肿瘤中最常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率［1］。胃癌早期症状并不明显，导致胃癌的早期诊断率较低［2］。阐明胃癌发生、发展的分子机制对寻找新的诊断标志物和治疗策略具有重要意义。微小RNA（miR）是一种内源性、非编码、单链小分子RNA，广泛表达于人体细胞［3］。miR通过抑制靶基因的表达，影响细胞的增殖、转移、凋亡、分化等功能［4］。越来越多的研究证明，miR在肿瘤的发生及发展过程起到关键作用［5］。miR-6886-5p是一个新发现的miR，其在肿瘤细胞中的表达和作用鲜有报道。2019 年10 月至2021 年1 月，本研究旨在检测胃癌细胞株中miR-6886-5p 的表达，探讨miR-6886-5p 对胃癌细胞增殖和迁移的影响以及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 胎牛血清、DMEM 培养基、RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；胃癌细胞株和正常胃黏膜上皮细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；Lipofectamine 3000转染试剂、实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）试剂盒购于购自美国Invitrogen 公司；淋巴细胞增殖检测（MTS）试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；LASP1 野 生 型（LASP1-WT）质 粒 及LASP1 突 变 型（LASP1-MT）质粒、miR-NC、miR-6886-5p 模拟物购于上海碧云天生物技术有限公司；所有抗体购于美国BD公司。

1.2 细胞培养和转染 在37 ℃、5% CO2培养箱中，HS-746T、SGC7901 和GES-1 细胞采用含10%胎牛血清DMEM 培养基培养，BGC823、MGC803采用含10%胎牛血清RPMI-1640 培养基培养。将HS-746T 细胞分为对照组（转染miR-NC）和miR-6886-5p 组（转染miR-6886-5p 模拟物），按照Lipofectamine 3000试剂说明书进行转染。

1.3 qRT-PCR 检 测miR-6886-5p 和LASP1 mRNA 表达 使用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA。建立qRT-PCR 反应体系，miR-6886-5p 表达量以U6 为内参，LASP1 mRNA 表达量以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt方法计算 。 引 物 设 计 如 下 ，GAPDH 正 向 引 物 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-6886-5p 正向 引 物：5’-AGCCCTCATCTCATCTGC-3’，反 向 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；LASP1 正 向 引 物：5’-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3’，反 向 引 物 ：5’-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3’；U6 正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物：5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.4 MTS 法检测HS-746T 细胞增殖水平 将各组HS-746T 细胞接种于96 孔板，进行MTS 法检测时，每孔加入20 μl MTS 试剂，在培养箱中培养4 h，使用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度（A）值，连续检测5次。

1.5 划痕愈合实验检测HS-746T 细胞迁移能力 将各组HS-746T 细胞接种于6 孔板，待细胞融合度达95%，使用10 μl 枪头在孔底划痕，每孔加入2 ml 不含血清的培养基，于显微镜下测量划痕宽度（W1）。在培养箱中培养24 h后，于显微镜下测量划痕宽度（W2），HS-746T 细胞划痕愈合率=（W1-W2）/W1×100%。

1.6 生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-6886-5p 的靶基因 使用microRNA.org 预测miR-6886-5p 的靶基因，LASP1 可能是miR-6886-5p 的靶基因。将HS-746T 细胞接种于96 孔板，将miR-NC、miR-6886-5p 模拟物与LASP1-WT 或LASP1-MT 共转染至HS-746T 细胞。培养48 h 后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.7 Western blot 检测miR-6886-5p 的靶基因蛋白表达 使用RIPA 裂解液提取各组HS-746T 细胞总蛋白，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，使用硝酸纤维素膜转膜，在5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入一抗在4 ℃孵育过夜，加入二抗在室温孵育2 h。使用超敏ECL 发光试剂盒进行显影，比较靶基因蛋白的表达。

1.8 统计学分析 使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两两组间比较应用独立样本t检验，多组间比较应用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌细胞株中miR-6886-5p 的表达 如图1，正常胃黏膜上皮细胞GES-1 和胃癌细胞株HS-746T、BGC823、MGC803、SGC7901 中miR-6886-5p 的表达分别为（1.08±0.07）、（0.23±0.05）、（0.42±0.02）、（0.69±0.06）和（0.55±0.04）。与GES-1 相比，胃癌细胞株中miR-6886-5p的表达显著降低（P＜0.05），表达最低的细胞是HS-746T 细胞（P＜0.01），因此选择HS-746T细胞进行后续实验。

图1 胃癌细胞株和正常胃黏膜上皮细胞GES-1 中miR-6886-5p的表达

2.2 各组HS-746T 细胞中miR-6886-5p 的表达 对照组和miR-6886-5p 组中miR-6886-5p 的表达分别为（1.17±0.40）和（9.48±1.10），miR-6886-5p 组是对照组的8.10倍（P＜0.01）。

2.3 miR-6886-5p 对HS-746T 细胞增殖能力的影响如图2，与对照组相比，miR-6886-5p 组细胞在第3、4、5 天的A值明显降低（均P＜0.05），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T细胞增殖。

图2 miR-6886-5p对两组HS-746T细胞增殖能力的影响

2.4 miR-6886-5p 对HS-746T 细胞迁移能力的影响对照组和miR-6886-5p 组细胞划痕愈合率分别为（63.42±5.58）%和（27.41±4.87）%。与对照组相比，miR-6886-5p 组细胞划痕愈合率明显下降（P＜0.01），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T细胞迁移（图3）。

图3 miR-6886-5p对HS-746T细胞迁移能力的影响

2.5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-6886-5p 的靶基因 双荧光素酶报告基因实验显示（图4），转染LASP1-WT 后再转染miR-6886-5p 的HS-746T 细胞相对荧光素酶活性较再转染miR-NC 组明显降低（P＜0.05），提示miR-6886-5p可靶向结合LASP1。

图4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-6886-5p 互补结合LASP1基因mRNA 3’UTR

2.6 miR-6886-5p对LASP1 mRNA表达的影响 对照组和miR-6886-5p 组细胞中LASP1 mRNA 的表达分别为（1.10±0.27）和（0.14±0.02），提示miR-6886-5p 可明显抑制LASP1 mRNA的表达（P＜0.01）。

2.7 LASP1 蛋白及相关蛋白的表达 Western blot 结果表明（图5），miR-6886-5p组HS-746T细胞LASP1蛋白表达降低，细胞增殖蛋白CDK4 表达降低，细胞迁移蛋白Snail表达降低。

图5 miR-6886-5p对两组LASP1蛋白及相关蛋白表达的影响

3 讨 论

miR 是近年来胃癌研究领域的热点［6］。Ding 等［7］研究发现，miR-146b-5p 在胃癌组织中低表达，上调miR-629 表达后胃癌细胞的增殖和迁移被抑制。He 和Zou［8］研究发现，miR-96-5p 在胃癌细胞系和胃癌患者血清中过表达，miR-96-5p 通过直接靶向叉头框蛋白O3 基因，加速胃癌细胞的增殖。miR-6886-5p 对胃癌增殖和迁移能力的作用尚不明确。本研究显示，miR-6886-5p 在胃癌细胞株中的表达明显低于正常胃黏膜上皮细胞，miR-6886-5p 可能表现为抑癌作用。本研究进一步通过MTS法和划痕愈合实验显示，上调miR-6886-5p 可明显抑制HS-746T 细胞的增殖和迁移能力，miR-6886-5p在胃癌中表现为抑癌作用。

miR 主要通过与靶基因mRNA 不完全配对结合，导致靶基因mRNA 的降解或者抑制其翻译，下调靶基因的表达［9］。本研究通过生物信息学软件microRNA.org 预测显示，miR-6886-5p 的靶基因可能是LASP1。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-6886-5p 能够靶向结合LASP1 mRNA。miR-6886-5p 可能通过调控LASP1 基因表达发挥作用。LASP1基因位于染色体17q21，其翻译的蛋白属于肌动蛋白结合蛋白家族［10］。近年来的研究显示，LASP1 蛋白在胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌等肿瘤中呈高表达，LASP1 蛋白能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移等活动［11］。下调LASP1蛋白表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移［12］。本研究通过qRT-PCR和Western blot检测显示，转染miR-6886-5p的HS-746T细胞中LASP1基因的表达明显下降，表明miR-6886-5p可靶向抑制LASP1基因的表达。同时，细胞增殖蛋白CDK4表达降低，细胞迁移蛋白Snail表达降低，间接表明HS-746T细胞的增殖和迁移能力降低。

综上所述，miR-6886-5p 在胃癌细胞株中表达下调，过表达miR-6886-5p 可通过靶向抑制LASP1 基因的表达，降低胃癌细胞的增殖和迁移能力。本研究可能为胃癌的诊断和治疗提供新的标志物和分子靶点。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。