槐定碱通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胶质瘤U87细胞迁移、侵袭

姜 羽 吕国伟 张文进 张 辉

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤[1，2]。Wnt通路是细胞内一条在进化过程中高度保守的信号通路，分为4个分支，其中Wnt/β-catenin是经典路径，在肿瘤细胞增殖、凋亡、间质转化等多个方面具有调控作用[3，4]。研究表明，Wnt/β-catenin 通路的异常激活与胶质瘤等多种肿瘤有关[3，4]。槐定碱具有抗炎等药理学活性[5]，对多种肿瘤细胞有调控作用[6，7]。本研究探讨槐定碱对人胶质瘤U87细胞系的生物学行为产生影响，为胶质瘤的治疗寻找新的有效药物提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 将胶质瘤U87 细胞株（中国科学院上海细胞库）于含10%胎牛血清和1%双抗的1640 培养液（美国Invitrogen 公司）中培养，待细胞生长汇合度达到80%以上时进行传代。以5×105个/孔密度接种于6 孔板培养16 h，加入槐定碱（上海将来实业股份有限公司，批号060736，纯度＞99.0%），浓度分别为0 mg/ml（对照组）、1.0（低剂量）、2.0（中剂量）、3.0（高剂量）mg/ml，每个浓度设置6 个复孔，继续培养24 h，光学显微镜下观察细胞形态。

1.2 细胞迁移U87 细胞与槐定碱共培养24 h，不含胎牛血清的RPMI-1640 培养液中饥饿处理12 h；用10 μl 的移液枪头垂直于板面划痕，每4 h 观察一次细胞迁移状态，倒置荧光显微镜下拍照，作图软件处理，计算每组细胞24时和0时的划痕宽度之比。

1.3 细胞侵袭U87 细胞与槐定碱共培养24 h，不含胎牛血清的培养基中饥饿处理12 h，胰蛋白酶消化后洗涤、离心，用不含胎牛血清的培养基重悬，调整密度约2×105个/ml；将Transwell 小室（上海Abcam公司）置于24孔板内，加入300 μl完全培养液，室温下静置30 min，使基质胶水化，向外室内加入500 μl完全培养液，将200 μl 细胞悬液接种于小室内，培养24 h，进行GISMA 染色，用棉签擦拭小室内侧，流水冲洗染液；用手术刀片将膜取下，置于载玻片上，于倒置显微镜下观察、计数并拍照；每张玻片取上下左右中5个视野计数细胞，取平均数。

1.4 免疫印迹法检测相关蛋白表达U87细胞与槐定碱共培养24 h，用RIPA 细胞裂解液裂解，提取蛋白质，凝胶电泳后，转移至NC 膜，含5%脱脂奶粉的TBST 摇育封闭2 h，先后加入稀释后的E-cadherin（1:1 000；美国Abcam 公司）、Vimentin（1:1 000；美国Abcam 公司）和基质金属蛋白酶（matrix metallopro⁃teinase，MMP）-9（1:1 000；美国Abcam公司）一抗、二抗（1:5 000），TBST 洗涤NC 膜；ECL 显色；将胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行灰度分析。

1.5 RT-PCR 检测相关mRNA 水平U87 细胞与槐定碱共培养24 h，Trizol（美国Gibco公司）提取总RNA，行逆转录反应。取2 μl RNA进行PCR扩增：内参βactin 正义链5'-CTAGGCTAGCGCTAATCGAC-3'，反义 链5'-TCGGCATTTATTACGCTAGA-3'；Vimentin正义链5'-GCTTAGCGCCCTAGCTAGGCT-3'，反义链5'-TCGGCTTAGCCGATCGATC-3'；MMP-9 正义链5'-TAGCTTTCGTAGCCTAGCCT-3'，反义链5'-TAGGCTTCGTACGATAACGA-3'（上海生工生物工程有限公司合成）。扩增条件：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用图像记录分析系统对目的基因、参比基因的条带灰度值进行分析。

1.6 统计学分析 用SPSS 19.0软件进行分析；计量资料以±s表示，用多因素方差分析和LSD-t检验；P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐定碱对U87细胞形态的影响 对照组U87细胞为梭形间质细胞状态，呈现上皮间质转化（epitheli⁃al-mesenchymal transition，EMT）形态变化；中剂量槐定碱组呈现正常上皮细胞形态。

2.2 槐定碱对U87 细胞迁移和侵袭活性的影响 与对照组相比，槐定碱组U87细胞迁移、侵袭活性显著降低（P＜0.001），且随药物浓度的增加，迁移、侵袭活性明显降低（P＜0.001）。见图1、2。

图1 划痕实验检测槐定碱对人胶质瘤U87细胞迁移能力的影响（40×）与0 mg/ml组相比，a P＜0.05；与1.0 mg/ml组相比，b P＜0.05；与2.0 mg/ml组相比，c P＜0.05

图2 Transwell小室实验检测槐定碱对人胶质瘤U87细胞侵袭能力的影响（100×）与0 mg/ml组相比，a P＜0.05；与1.0 mg/ml组相比，b P＜0.05；与2.0 mg/ml组相比，c P＜0.05

2.3 槐定碱对U87 细胞β-catenin 和E-cadherin 蛋白表达的影响 槐定碱组U87 细胞β-catenin 蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.001），且随药物浓度的增加而明显降低（P＜0.001）；槐定碱组U87细胞E-cad⁃herin蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.001），且随药物浓度的增加而明显增高（P＜0.001）。见图3。

图3 免疫印迹法检测槐定碱对人胶质瘤U87细胞β-catenin、E-cadherin蛋白表达的影响与0 mg/ml组相比，a P＜0.05；与1.0 mg/ml组相比，b P＜0.05；与2.0 mg/ml组相比，c P＜0.05

2.4 槐定碱对U87细胞Vimentin和MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响 槐定碱组U87 细胞Vimentin 和MMP-9 mRNA 和蛋白表达这篇均显著低于对照组（P＜0.01），且随药物浓度的增加明显降低（P＜0.01）。见图4、5。

图4 免疫印迹法检测槐定碱对人胶质瘤U87细胞Vimentin、MMP-9蛋白表达的影响与0 mg/ml组相比，a P＜0.05；与1.0 mg/ml组相比，b P＜0.05；与2.0 mg/ml组相比，c P＜0.05

图5 RT-PCR 检测槐定碱对人胶质瘤U87 细胞Vimentin、MMP-9mRNA表达的影响

3 讨论

EMT 指源于上皮的肿瘤细胞失去极性，向具有间质表型细胞转化的过程[8]。Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活是导致EMT 的重要因素[3，8～10]，该信号通路与胶质瘤的发展有密切关系[11]。

槐定碱是中药苦豆子的有效活性成分之一，能通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖、侵袭[5～7]。研究发现，槐定碱能通过抑制NF-κB介导的抗凋亡通路及激活Caspase 级联反应，诱导胶质瘤细胞的凋亡[12]。另有研究证实，槐定碱能通过诱导ROS聚集，激活线粒体途径而发挥抗肿瘤活性[13]。本研究发现，槐定碱能抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。为了进一步探讨槐定碱对胶质瘤U87 细胞可能存在的作用机制，我们进一步检测了Wnt/β-catenin 通路中因子的表达。本研究发现，槐定碱能显著抑制细胞内βcatenin 的表达，提示槐定碱可能对人胶质瘤细胞内Wnt/β-catenin 信号通路的活性具有抑制作用。βcatenin 参与胶质瘤细胞的增殖和侵袭过程的调控，当其表达被抑制后，胶质瘤细胞的增殖和侵袭相应受到影响[14]。

E-cadherin 是Wnt 信号通路中一个重要的因子，其表达缺失是EMT过程的重要标志[9，10]。可以通过恢复E-cadherin的表达而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭活性[10，15]。本研究结果发现，槐定碱能有效促进细胞内E-cadherin 的表达，我们推测槐定碱对人胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制，与抑制细胞内Wnt/βcatenin 活性，同时刺激E-cadherin 表达而抑制EMT过程有关。在肿瘤细胞中，占主导地位的Ecadherin的表达降低能导致肿瘤细胞播散，同时能增加细胞内Vimentin 的活性[9]。Vimentin 主要作用在于调节细胞收缩、黏附和迁移，是EMT 途径另一重要的蛋白之一[9，10]。本研究发现，槐定碱在促进人胶质瘤细胞内E-cadherin表达的同时，能抑制Vimentin的活性，我们推测槐定碱可能通过刺激人胶质瘤细胞内E-cadherin 表达，抑制Vimentin 的活性，而阻断细胞内EMT过程，减弱细胞的迁移和侵袭能力。

MMP-9为Wnt 信号通路另一重要下游靶基因，为降解细胞外基质和基底膜的关键酶，也可以诱导EMT过程[16]。本研究发现，槐定碱能抑制MMP-9的表达，进一步说明槐定碱对人胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的抑制作用与其对Wnt/β-catenin 信号通路活性的抑制作用密切相关。

综上所述，槐定碱能抑制人胶质瘤U87 细胞的迁移和侵袭，机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的活性，阻断EMT过程。