云南省曲靖地区手足口病病原学监测（2019年）

李桂满张勇刘艳艳姜黎黎伏晓庆田炳均

1昆明市疾病预防控制中心微生物检验科650228；2云南省疾病预防控制中心急性传染病防制所，昆明650022

李桂满和张勇对本文有同等贡献

手足口病（HFMD）是全球广泛流行的儿童传染病[1]。2008年中国大陆发生了大规模的HFMD流行[2-3]，同年5月2日，HFMD被正式纳入我国丙类法定传染病管理[4]，随后逐步成立了全国HFMD实验室监测网络，并对其开展系统性研究。然而，对云南省曲靖地区HFMD的研究尤其是病原学研究鲜少报道。本研究对2019年曲靖地区HFMD的病原学进行分析，为今后曲靖地区开展防控提供病原学基础，现将结果报告如下。

对象与方法

一、研究对象

2019年云南省曲靖地区各乡镇、县及州（市）医院临床诊断为HFMD的门诊及住院患儿为研究对象，病例诊断标准参照《手足口病实验室手册（2018年版）》[5]。所有诊断为HFMD的病例均纳入研究，并排除临床诊断为麻疹和风疹等其他病例。采集粪便样本前已经过儿童监护人的知情同意，研究符合赫尔辛基宣言。

二、研究方法

收集所有临床诊断为HFMD患儿的一般资料（包括姓名、年龄、性别、发病日期、出疹部位、最高体温、家庭住址、并发症和采样日期等），采集所有就诊和住院患儿的粪便样本。样本保存于粪便样本采集保存管 （领因生物科技上海有限公司），置于-20℃环境中保存。在冷藏条件下送云南省CDC的HFMD实验室进行病原检测。

三、样本处理

2019年云南省CDC的HFMD实验室共收到曲靖地区HFMD病例的粪便样本470份，样本处理严格按《手足口病实验室手册（2018年版）》[5]进行，即在50 mL耐氯仿的离心管中加入10 mL磷酸缓冲液（PBS），1 g玻璃珠、1 mL氯仿。在生物安全柜中将每一份粪便样本取约2 g加入标记好的离心管中，拧紧离心管盖子，用震荡器剧烈震荡20 min，在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机1 500×g离心20 min。将上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中，一管冻存于-20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备提取病毒核酸。

四、病毒RNA提取

病毒RNA提取采用江苏硕世生物科技股份有限公司全自动核酸提取仪（型号：SSNP-2000A）（磁珠法）提取，按照试剂盒说明书进行操作。提取所用样本为200 mL，RNA提取物为60 μL。

五、RT-PCR和病毒型别鉴定

先用MD91/OL68-1引物[6]对病毒VP4区基因进行RT-PCR和测序，编辑后的序列在GenBank进行BLAST搜索，确定病毒型别，再用各型病毒的相关引物[7]扩增肠道病毒（EV）VP1区全序列并测序。RT-PCR试剂盒为Access Quick RT-PCR（美国Promega公司）。RT-PCR程序为：50℃30 min，95℃15 min；94℃30 s，45℃30 s，68℃50 s，共40个循环，最后在68℃延伸10 min。PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行双向测序，并用Sequencher 4.0软件（美国Gene Codes公司）进行编辑、拼接，得到病毒VP1区基因完整序列。测序结果通过肠道病毒在线定型工具 （Enterovirus Genotyping tool Version 0.1）[8]进行病毒型别鉴定。

六、病毒遗传系统进化树分析

用Mega5.2软件进行进化树分析。进化树用临位相接法（neighbor-joining method）作成，所用模式为Kimura二参数置换法 （Kimura 2-parameter substitution model）。用1 000个pseudoreplicate datasets进行进化树boot strap统计学分析。

结 果

一、病例基本情况

2019年云南省曲靖地区共有HFMD临床诊断病例470例，男性289例，女性181例，性别比为1.60∶1；年龄最小5月龄，最大15岁。病例多见于3岁以下非幼托散居儿童，占47.45%（223例），其次为幼托儿童，占37.45%（176例），学生占15.11%（71例）。

470例HFMD病例均属于普通型，无重症病例，主要表现为发热，手、足、口、臀等部位出疹，并有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。8例体温超过38.5℃；21例表现为皮疹或疱疹性咽峡炎。HFMD病例全年都有检出，发病高峰在5—10月，其中6月为最高峰（图1），阳性病例共70例，占总病例数的13.19%。

图1 2019年曲靖市手足口病发病时间分布

二、病原谱构成

470份粪便样本中共检测到62株EV毒株，阳性率为13.19%。62株EV毒株中，42株为EV-A组病毒（67.74%），其中柯萨奇病毒A10型（CV-10）21株（33.87%），CV-A4 1株（1.61%），CV-A6 8株（12.90%），CV-A16 12株（19.35%）；9株为EV-B组病毒（14.52%），其中E11和E12各3株（4.84%），E14 1株（1.61%），E30 2株（3.22%）；EV-C组病毒11株，均为脊灰病毒1型疫苗株（PV1，Sabin株），占阳性总数的17.74%。未检测到EV-A71型和EV-D组病毒。

本次研究，62株毒株中共有5株混合病毒株，样本181-QJ-YN-CHN-2019（以下简称181）由E30和PV1（均为疫苗株，下同）混合，254和320由CVA16和PV1混 合，397和405由CV-A10和PV1混合。

三、CV-A6基因特征

2019年共从曲靖地区HFMD病例中检测到8株CV-A6。按文献[9]下载CV-A6病毒参考株VP1区序列，进行基因进化分析，8株CV-A6均为D3a亚型（图2）。

图2 2019年曲靖地区柯萨奇病毒A6型VP1区基础进化树

四、CV-A10基因特征

2019年共从曲靖地区HFMD病例中检测到21株CV-A10毒株。按文献[10]下载CV-A10病毒参考株VP1区序列，进行基因进化分析，21株CV-A10分为两个不同的进化分支，分支1由13株组成，分支2由8株组成，两个进化分支之间的核苷酸（nt）差异率为7.00%，氨基酸（aa）差异率为7.40%，分支1与原 型株Kowalik（AF081300）的nt差异率为23.10%，aa差异率为7.40%。分支2与原型株Kowalik的nt差 异 率 为23.90%，aa差 异 率 为6.90%。基因树中两个进化分支之间的boot strap值为100%，为两个不同的基因亚型（图3）。

图3 2019年曲靖地区柯萨奇病毒A10型VP1区基因进化树

五、CV-A16基因特征

2019年共从曲靖地区HFMD病例中检测到12株CV-A16毒株，按文献[11]下载CV-A16病毒VP1区参考株序列，构建基因进化树，12株CV-A16属于两个基因亚型（B1a和B1b），B1a亚型由4株组成，B1b亚型由8株组成，两组之间的nt差异率为12.00%，aa差异率为1.70%，B1a亚型与原型株G-10（U05876）之间的nt差异率为24.40%，aa差异率为8.00%，B1b亚型与原型株G-10之间的nt差异率为24.90%，aa差异率为8.60%，B1a亚型与B1b亚型之间的boot strap值为97%～99%（图4）。

图4 2019年曲靖地区柯萨奇病毒A16型VP1区基因进化树

讨 论

本文对云南省曲靖地区2019年HFMD的病原学进行了研究，发现主要病原是CV-A10，其次是CV-A16和CV-A6。

最近几年，由CV-A6和CV-A10引起的HFMD散发和暴发事件日益增加。2012年印度的研究表明，CV-A16和CV-A6是HFMD的主要病原体[12]。陈炜等[13]发现2011—2013年福建省HFMD病原谱发生较大变化，CV-A6成为福建省主要病原之一。张萌等[14]研究显示，2017—2018年，引起北京及其周边地区儿童HFMD的主要病原体是CV-A16，EV-A71的检出率已显著下降。以上研究均表明，HFMD的病原谱已经发生改变，主要病原已从EV-A71变为CV-A6、CV-A10和CV-A16。Song等[9]对1992—2015年中国520条和基因库下载的287条CV-A6病毒VP1区基因进行了进化分析，把CV-A6分为A、B、C、D四个基因型，D基因型又被分为D3a和D3b两个亚型。本文在曲靖市共发现8株CV-A6毒株，占阳性数的12.90%，基因进化分析表明它们都属于D3a亚型，与Song等[9]的结果一致。

Ji等[15]对2009—2016年中国27个省164条CV-A10代表株和117条从GenBank下载的CV-A10病毒VP1区完整序列进行了遗传进化分析，结果显示C2亚型是自2012年以来中国主要的流行亚型。本次曲靖地区CV-A10进化分析表明，21株病毒全为C2基因亚型，并分为2个进化分支，说明C2基因的两个进化分支同时在该地区流行。

Zhang等[11]对2007—2008年分离自山东、甘肃、内蒙古和青海的42株，1999年和2005年分离自北京和广东的24株以及从GenBank下载的35株共101株CV-A16病毒的VP1区基因进行的遗传进化分析，结果显示，1999—2008年所有中国分离株都属于B1a和B1b亚型，这两个亚型是中国的主要流行分支。本次曲靖地区CV-A16进化分析结果显示，2019年12株病毒全为B1亚型，B1a（4株）和B1b（8株）两个进化分支同时在该地区流行。

云南省HFMD实验室监测网络中，每年各地州都用实时荧光RT-PCR方法进行病原学检测。本研究先用MD91/OL68-1引物扩增病毒VP4区基因并定型，再用各组病毒特异性引物扩增VP1区基因用于基因特征分析。MD91/OL68-1引物几乎能够扩增所有EV[6]，但EV基因VP4区只有207 bp，能够定型但不适用于进化树分析，而VP1区全序测定是EV基因进化分析最可靠的手段。VP4区和VP1区的结合使用是EV测序定型和基因进化分析行之有效的方法，值得全国推广使用。

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