凝胶色谱法（GPC）检测特殊膳食食品中小分子肽的分子量分布的研究

◎ 黄伟乾，霍玟希，罗 浩，何敏恒，梁志森，覃天福，邱俊杰

（1.国家加工食品质量检验中心（广东），广东 广州 511447；2.广州检验检测认证集团有限公司，广东 广州 511447）

肽是介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内发挥生理功能，起重要生理作用。具有活性的多肽称为活性肽，又称生物活性多肽。一般认为，由2～9个氨基酸组成的就叫作寡肽，10～15个以上氨基酸组成的肽被称为多肽，由2～15个氨基酸组成的就叫作小分子肽，分子量一般在50～5 000 Da。小部分因其结构简单，分子量小，不饱和度高，所以能够通过细胞膜渗透进入细胞内，不需要再次消化，也不需要耗费能量，具有100%吸收的特点，可直接体现生物活性。

常见的特殊膳食类产品包括婴幼儿配方乳粉、婴幼儿谷物辅助食品、特殊医学用途配方食品[1]、运动营养食品[2]等，此类食品为满足特殊的身体或生理状况和（或）满足疾病、紊乱等状态下的特殊膳食需求，专门加工或配方的食品，其中适度或深度水解配方产品可降低特殊人群的蛋白质过敏反应。

目前报道的检测肽类物质的方法主要有液相色谱法[3-5]、液质联用法[6]、重量法[7]等。特殊膳食食品中的小分子肽的分子量分布检测未见报道。凝胶渗透色谱 （Gel Permeation Chromatography，简称GPC）又称为尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC），它是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相分离相对分子质量较小的物质，并对分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物进行分析。本研究采用凝胶色谱分离[8-17]技术，通过优化色谱条件建立了肽分子量[18-20]分布的检测方法。本方法前处理简单、快速，可用于特殊膳食食品中肽分子量分布的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

U3000高效液相色谱仪（配PDA检测器，Thermo公司）；漩涡混合器（MS3 basic，IKA公司）；去离子水发生器（Milli-Q，Millipore公司）；高速离心机（30-K，sigma公司）。

1.2 材料与试剂

细胞色素C（分子量12 500 Da），胰岛素（分子量5 807.69 Da），杆菌肽（分子量1 421.7 Da），甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451.48 Da），谷胱甘肽（分子量307.32 Da），L-半胱氨酸（分子量121.15 Da），维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C购自安谱公司；乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，购于Fisher公司；去离子水（＞18.0 MΩ·cm）由Milli-Q纯水系统制备。

1.3 试验方法

1.3.1 肽标准溶液配制

分别称取6种肽标准品5 mg（精确到0.01 mg），用流动相溶解定容于5 mL容量瓶中，成1.0 mg·mL-1标准溶液，置于4 ℃下保存1个月。

1.3.2 色谱条件

串联2支TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.06%（v/v）三氟乙酸溶液；等度洗脱：0.0～45.0 min，10% A+90% B；流速0.7 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长220 nm；进样量5 μL。

1.3.3 样品处理

移取样品20～50 mg于10 mL容量瓶中，用流动相振荡溶解，超声10 min充分提取后定容。在15 000 r·min-1高速离心5 min，取上清液过0.22 μm尼龙滤膜，待HPLC分析。

1.4 肽分子量分布的判断方法

特殊膳食食品经酶解工艺或添加水解蛋白原料，使样品中含有较多的小分子肽，将样品溶解于流动相，经凝胶色谱过滤，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，肽键的特征紫外吸收波长为220 nm，以常见的肽对照品的分子量为识别区间，以界定出样品中的多肽的分子量分布范围。

2 结果与讨论

2.1 流动相条件的确定

为考察流动相对样品分离结果的影响，采用5组乙腈-0.06%三氟乙酸溶液流动相体系（25∶75、20∶80、15∶85、10∶90和5∶95）进行实验，结果显示，以流动相乙腈-三氟乙酸为10∶90时分离效果好，而且峰形较理想，保留时间适中。

2.2 标准曲线的绘制

通过高效液相色谱确定标准肽的保留时间，见表1，得到系列标准品的色谱图，以分子量的对数（lgM）对保留时间作图，经线性回归得到分子校正曲线方程y=-0.3167x+14.436（R2=0.949 5），见图1。

图1 肽标准的分子量对数与保留时间曲线图

表1 肽标准品的色谱保留时间表

2.3 精密度试验

选取未进行水解处理的样品，分别添加6种对照肽标准品，按本方法连续测试6次，6种肽对照品保留时间的相对标准偏差分别为0.20%、0.06%、0.03%，0.06%、0.03%和0.08%，表明具有良好的精密度，能够满足测定要求。

2.4 水溶性维生素的干扰评估

小分子肽类物易溶水相溶液中，特殊膳食食品一般添加少量的水溶性维生素（主要有维生素B1、维生素B2、烟酸、维生素B6、维生素C），样品经本方法前处理稀释200倍计，以最大含量水平进行评估。实验结果表明，B族水溶性维生素虽出峰时间较前，但样品经200倍稀释后，基本不干扰结果；含量最高维生素C的保留时间＞31 min，其他几种水溶性维生素的峰高低于半胱氨酸标准峰的3%，并未对分子量分布情况的色谱图产生明显的影响。

2.5 对特膳样品进行检测

样品经流动相溶解处理，样品中小分子肽溶于流动相溶液中，其中以肽对照品的出峰时间作为判断点，对市售的3种样品进行分析（婴儿配方乳粉、特殊医学用乳蛋白适度水解配方粉、特殊医学用乳蛋白深度水解配方粉），结果见表2。

表2 样品中肽分子检测结果表

响应值越高，区间肽段的占比越高。比较3组的结果发现，婴儿配方奶粉的水解程度较低，适度水解类产品在5 807.6～370.3 Da分布较均匀，水解程度较婴儿配方奶粉高。经样品测试表明，深度水解配方的蛋白质水解程度较适度配方高。由图2可知，深度水解配方产品的肽分子分布较集中在1 421.7～370.3 Da，说明水解强度较大。

图2 深度水解样品的小分子肽分布色谱图

3 结论

本研究通过GPC凝胶色谱法测定6种肽分子量对照品，建立分子量分布的检测方法。该方法的6种肽分离效果较好，较准曲线具有较好的稳定性。该方法前处理简单，可用于特殊膳食中小分子肽分布的检测，得到有价值的小分子肽信息，为调整产品研发方向提供参考。