超高效液相色谱-串联质谱法测定侗族腌鱼中硝基呋喃代谢物残留量

2021-11-06龙姜柳管春成刘桂琼

现代食品 2021年17期

◎ 龙姜柳，管春成，刘桂琼，杨坤

（黔东南州食品药品检验检测中心，贵州凯里 556012）

腌鱼是贵州省黔东南州侗族地区特色传统发酵美食，稻田鲤鱼、草鱼通过食盐腌制后，加入醪糟、白酒、生姜、花椒等辅料混合均匀，放入坛内密封自然发酵3个月以上而成的特色鱼制品[1-3]。因其有助消化、含人工无法合成的氨基酸和特色风味等特点，深受当地人们的喜爱。

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数真菌和病毒具有较好的杀灭作用，且价格低廉，在水产养殖领域被广泛用于治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引发的疾病[4-6]。因硝基呋喃原药在动物体内代谢快，半衰期短，检测其原药不足以反映真实的残留情况，因此检测其代谢物成为当前国内外研究的热点[7-14]。

目前，我国水产品检测硝基呋喃代谢物残留的国家标准[15-16]主要采用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，净化效果差，有很强的基质干扰，在检测成分更加复杂的侗族腌鱼时目标化合物基质效应严重，严重影响检测结果的准确度。倪杨等[17]采用QuEChERS法净化，净化效果优于正己烷，但该方法仅在蜂蜜样品上验证，并未对鱼等水产品样品进行试验。因此，本文采用QuEChERS法研究建立快速净化复杂样品——侗族腌鱼基质中硝基呋喃代谢物的前处理方法，同时为鱼类等水产品中硝基呋喃代谢物的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌鱼样品：5批次购于锦屏县，3批次购于黎平县，3批次购于从江县，2批次购于榕江县，4批次购于凯里市。

呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）和呋喃西林（SEM）（100 μg·mL-1，坛墨质检）；4种硝基呋喃代谢物同位素内标（100 μg·mL-1，坛墨质检）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；2-硝基苯甲醛（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸钾（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；QuEChERS兽药提取包和净化管（日本岛津公司），水为实验室自制超纯水。

1.2 仪器与设备

AB 4000+型液质联用系统（配电喷雾离子源（ESI），Analyst1.6.3数据处理软件，美国应用生物系统公司）；Agilent 1290型液相色谱仪（配二元高压泵，自动进样器，美国安捷伦公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美国Waters公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；ML104电子天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多（上海）仪器公司）；3-18k型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

剔除鱼头和刺，取鱼肉切成小块，充分匀浆，保存于-18 ℃，备用。称取2.00 g样品于50 mL离心管中，加入0.2 mol·L-1盐酸溶液10.0 mL，2 000 r·min-1振荡2 min，加入2-邻硝基苯甲醛溶液0.10 mL，内标物质0.10 mL。于60 ℃水浴上加热2 h，取出样品冷却至室温，加0.3 mol·L-1磷酸钾溶液1 mL，用2.0 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至7.4±0.2。加入10.0 mL乙腈溶液，摇匀，加入QuEChERS盐包，涡旋1 min，于8 000 r·min-1下4 ℃离心5 min。吸取上清液于QuEChERS净化管中，摇匀，静置2 min，取上清液1.00 mL于10 mL玻璃瓶中40 ℃氮吹至近干，用1.00 mL初始流动相复溶，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；流速为0.30 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min，90%A；3.0～4.0 min，50%A；4.1～6.0 min，90%A。

（2）质谱条件。电喷雾正离子电离模式（ESI+），去溶剂温度（TEM）：550 ℃；气帘气压力（CUR）：172 kPa；碰撞气压力（CAD）：41 kPa；离子气1压力（GS1）：414 kPa；离子气2压力（GS2）：379 kPa；离子喷射电压（IS）：5 500 V；扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。以子母离子的保留时间和丰度比定性，以峰面积定量。

1.4 基质标准曲线配制

向腌鱼阴性样品中分别添加浓度为1.00 μg·L-1、2.00 μg·L-1、4.00 μg·L-1、6.00 μg·L-1、10.00 μg·L-1和20.00 μg·L-1的4种硝基呋喃代谢物混合标液，按照1.3.1项前处理方法测定，以标准工作液质量浓度为横坐标，标准工作液响应值与其内标响应值之比为纵坐标，制作标准工作曲线，内标法定量。

1.5 加标回收实验

向腌鱼阴性样品（样品未检出）按方法1.3.1方法处理中分别添加100 μL、300 μL、500 μL质量浓度为100 μg·L-1硝基呋喃代谢物混合液（0.005 mg·kg-1、0.015 mg·kg-1和0.025 mg·kg-1浓度水平），平行测试6次，并计算检出限、精密度和回收率。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 衍生时间和温度的优化

分别在40 ℃、50 ℃和60 ℃环境下衍生1 h、2 h、3 h、4 h和5 h对4种硝基呋喃代谢物进行衍生对比，结果见图1。从图1可知，在60 ℃下衍生2 h的平均回收率大于97%，因此选择在60 ℃下衍生2 h。

图1 衍生温度和衍生时间对4种硝基呋喃代谢物的影响图

同时，分别对衍生后的标准溶液进行间隔20 h、44 h、66 h重复测试，其检测结果与衍生后马上测试值偏差均小于5%，因此，4种硝基呋喃衍生物衍生后稳定性效果较好。

2.1.2 衍生剂用量的优化

按照1.3.1方法分别选择用2-邻硝基苯甲醛0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL和0.40 mL对4种硝基呋喃代谢物进行衍生，结果见图2。SEM使用0.30 mL衍生剂峰面积最大，AOZ在0.05 mL衍生剂下峰面积最大，AHD和AMOZ在0.10 mL衍生剂峰面积最大。因此，选择加入2-邻硝基苯甲醛0.10 mL衍生剂。

图2 衍生剂用量对4种硝基呋喃代谢物的影响图

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 质谱条件优化

对硝基呋喃类代谢物混合标准溶液进行衍生化处理，得到NP-AOZ、NP-SEM、NP-AHD和NP-AMOZ混合标准溶液，将该混合标准溶液通过针泵以流动注射的方式在电喷雾模式下进行母离子和子离子扫描，并优化去簇电压、碰撞能量等参数条件，以达到最佳灵敏度。优化后的质谱条件如表1所示。

表1 4种硝基呋喃代谢物及其内标物质质谱参数表

2.2.2 液相条件优化

倪杨等[17]对BEH C18、HILIC和HSS T3 3种不同型号的柱子进行测试，发现BEH C18柱对其分离效果好，高海波等[18]也选用BEH C18柱作为分离柱。因此，本文选用Waters BEH C18柱作为分离柱。

采用乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸铵）和乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸铵、0.1%甲酸）流动相体系优化。在梯度洗脱条件下，采集时间6 min，流速0.30 mL·min-1，柱温35 ℃条件下，发现乙腈-水（含0.1%甲酸）作为流动相使目标物离子化提高，峰形尖锐。在MRM模式下测定，侗族腌鱼基质中添加2 ng·mL-1的4种硝基呋喃类代谢物混合标样的色谱图见图3。

图3 侗族腌鱼基质加标的4种硝基呋喃代谢物的内外标多反应检测色谱图

2.3 基质效应的影响

基质效应是分析过程中由待测物以外的其他物质的存在直接或者间接影响待测物响应，造成严重干扰，影响分析结果的准确性。按“1.4”方法配制腌鱼基质匹配标准溶液及流动相初始溶液配制标准溶液，按公式（1）计算基质效应（ME）：

式中：K1和K2分别表示基质匹配标准曲线斜率和纯溶剂标准曲线斜率，ME越接近1，则基质效应越小。

4种硝基呋喃代谢物在腌鱼中的基质效应见图4。结果显示，硝基呋喃代谢物在腌鱼基质中只有呋喃西林代谢物存在较小的基质抑制效应，其他3种呋喃代谢物在腌鱼基质中不存在明显的基质增强效应。因此，本实验采用基质匹配的标准溶液来定量，以抵基质效应的干扰。

图4 侗族腌鱼4种硝基呋喃代谢物的基质效应图

2.4 方法学评价

在优化的UPLC-MS/MS分析条件下，按照1.3.2中的条件对基质标准曲线进行检测。4种硝基呋喃代谢物在一定质量浓度范围内与对应的峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.999 81～0.999 97，以定量离子3倍信噪比（S/N=3）得到检出限（LOD）为0.5～1.0 μg·kg-1，以定量离子10倍信噪比（S/N=10）得到定量下限（LOQ）2.0～3.0 μg·kg-1，侗族腌鱼4种硝基呋喃代谢物的标准曲线和相关系数见表2。