功能性工程米对斑马鱼酒精性肝损伤的保护作用

◎ 杜玉兰，严建刚，毛新亮，吴晓春，柳 嘉，段盛林，李晓敏

（1.完美（广东）日用品有限公司，广东 中山 528400；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；3.广东完美生命健康科技研究院有限公司，广东 中山 528400）

肝脏是人体功能最多、最复杂的，也是参与食物代谢最重要的器官，在身体里扮演着去氧化、储存糖原及合成蛋白质、胆汁等作用。肝脏损伤时会导致糖耐量降低、蛋白质和脂类代谢紊乱、水和电解质紊乱、三酰甘油增多、血氨增高及凝血功能障碍等问题[1]，所以肝病一直以来都是危害人类健康的一大杀手。

市场上也研制成功出一些护肝的保健食品和药品，不过目前此类产品多数效果不明显，或者有毒副作用，存在一定的市场局限性。完美（中国）有限公司与中国食品发酵工业研究院合作，经过多年深入研究开发出一款具有高蛋白且富含洛伐他丁、原花青素、黄酮类等活性成分的功能米。因此，本研究利用斑马鱼酒精肝损伤模型测定和比较斑马鱼肝脏脂肪光密度及功能米保肝护肝作用，明确完美（中国）有限公司研发的功能米保肝、护肝的功效。

斑马鱼是一种脊椎动物亚门辐鳍鱼纲鲤科的小型鱼类，具有饲养方便、繁殖能力强、胚胎透明、能在显微镜下进行实时观察等特点，最重要一点是其基因序列与人类基因序列保持高度的相似性[2]，其心血管系统、视觉系统、肝脏等消化系统以及神经系统等的发育机制和特点都与人类极其相似[3]。斑马鱼也被美国食品药品监督管理局（FDA）列为继人和啮齿类鼠之后的第三大模式生物，已广泛应用于生命科学研究和药物筛选中[4-5]。本研究利用1%无水乙醇斑马鱼酒精肝损伤模型，通过Image-Pro Plus 6.0图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肝脏脂肪光密度、保肝作用，评价样品保肝、护肝功效。此评价方法成本低、耗时短、简单、直观，对以后评价样品保肝、护肝作用有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼，以自然成对交配方式进行繁殖。年龄为受精后5 d，饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS·cm-1；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg·L-1CaCO3），实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.2 样品与试剂

1.2.1 样品

完美牌幸馥稻（宜甘）样品（简称RD045-01功能性工程米）：完美牌幸馥稻（宜甘）是以糙米、大豆分离蛋白、葛根提取物、玉米肽、山楂粉、紫薯粉和黑米粉等为主要原料制成的紫色、米形功能米，样品用粉碎机打成粉末后用纯水配制成50 mg·mL-1母液，摇床上下混匀1 h后，离心取上清用作功效评价，用养鱼用水按需稀释。

RU-21安体普解酒片，白色片剂，购自Spirit Sciences USA，临用时用纯水配制成100 mg·mL-1的母液备用，用养鱼用水按需稀释。

1.2.2 试剂

无水乙醇、甲基纤维素，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；油红O，购自Sigma；4%多聚甲醛，购自鼎国生物。

1.3 仪器与设备

SZX7解剖显微镜（Olympus）、TK-C1481EC显微镜相连的相机、CP214精密电子天平（Ohaus）。

1.4 动物模型的建立

用1%的无水乙醇处理5 dpf黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼30 h，建立斑马鱼酒精性脂肪肝模型。

1.5 RD045-01功能性工程米对斑马鱼身体状况的影响

随机选取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，用1%的无水乙醇诱发斑马鱼酒精性脂肪肝。分别水溶给予RD045-01（功能性工程米）500 µg·mL-1、1 000 µg·mL-1、1 500 µg·mL-1和2 000 µg·mL-1浓度，同时设置正常对照组（养鱼用水处理斑马鱼）和模型对照组，每孔（实验组）容量为3 mL。RD045-01（功能性工程米）与无水乙醇共同处理30 h后，观察记录斑马鱼的表型和死亡情况，根据斑马鱼的毒性反应和死亡情况确定RD045-01（功能性工程米）对酒精性脂肪肝模型斑马鱼身体状况的影响。

1.6 RD045-01功能性工程米对斑马鱼酒精性脂肪肝保护作用

1.6.1 分组及给样

随机选取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）30尾斑马鱼，用无水乙醇诱发斑马鱼酒精性脂肪肝。分别水溶给予RD045-01功能性工程米222 µg·mL-1、667 µg·mL-1和2 000 µg·mL-1浓度，阳性对照药“RU21”50 μg·mL-1浓度，同时设置正常对照组（养鱼用水处理斑马鱼）和模型对照组，每孔（实验组）容量为3 mL。处理时间为30 h。

1.6.2 评价方法

实验结束后，用油红O进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肝脏脂肪光密度总和（S），并进行分析统计，根据统计学意义评价样品肝保护作用，统计学处理结果用mean±SE表示，样品肝保护作用计算公式如下：

1.6.3 统计学方法

用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p＜0.05表明具有显著性差异，p＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 RD045-01功能性工程米对斑马鱼身体状况的影响

在实验期间观察期间斑马鱼的表型状态良好，活动自如，无一尾斑马鱼死亡。说明RD045-01功能性工程米在2 000 µg·mL-1浓度及以下时，对酒精性脂肪肝模型斑马鱼未产生任何明显的毒副作用，也未引起死亡。详见表1。

表1 各实验组对斑马鱼身体状况的影响表（n=30）

2.2 RD045-01功能性工程米对无水乙醇诱发的斑马鱼酒精性脂肪肝的保护作用

斑马鱼用油红O进行染色，在解剖显微镜下拍照分析，斑马鱼肝组织病理变化情况见图1。

图1 各实验组对斑马鱼肝脏形态变化影响图

用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肝脏脂肪光密度总和（S），并进行分析统计，根据统计学意义评价样品肝保护作用，统计学处理结果用mean±SE表示。处理数据汇总见表2。

表2 各实验组对斑马鱼肝脏脂肪光密度总和及保肝护肝作用对比表（n=10）

由表2可知，模型对照组斑马鱼肝脏光密度总和（2 954像素）与正常对照组（997像素）相比差异性极显著（p＜0.01），表明模型建立成功；阳性对照药“RU21”50 μg·mL-1浓度组斑马鱼肝脏光密度总和为2 022像素，与模型对照组相比差异性极显著（p＜0.01），其对斑马鱼保肝护肝作用为48%，说明“RU21”阳性对照药对斑马鱼酒精性脂肪肝有保护作用；RD045-01功能性工程米222 µg·mL-1、667 µg·mL-1和2 000 µg·mL-1浓度组斑马鱼肝脏光密度总和分别为2 720、2 705和2 179像素，保肝护肝作用分别为12%、13%和40%，与模型对照组比较，222 µg·mL-1和667 µg·mL-1浓度组p＞0.05，2 000 µg·mL-1浓度组p＜0.01，表明RD045-01功能性工程米在2 000 µg·mL-1浓度条件下对斑马鱼酒精性脂肪肝有保护作用。对比分析详见图2和图3。

图2 各实验组对斑马鱼肝脏光密度总和对比图

图3 各实验组对斑马鱼肝保护作用对比图

3 结论

本研究中的RD045-01功能性工程米是以糙米、大豆分离蛋白、紫薯粉、黑米粉为主要原料并添加葛根提取物、玉米肽、山楂提取物、红曲米等功效成分，通过生物耦合挤压重组技术制成的营养丰富，蒸煮后风味、形状等与普通大米类似的一种工程米。通过斑马鱼实验证明RD045-01功能性工程米对无水乙醇诱发的斑马鱼酒精性脂肪肝有保护作用，且呈剂量正相关性。其作用机理可能是RD045-01功能性工程米能增强体内乙醇代谢，减少肝损伤，恢复肝活力。