超声辅助乙醇提取金银花中黄酮化合物研究

◎ 白玲燕

（北京可佳食品配料有限公司，北京 100176）

金银花又名忍冬、银花[1]，属忍冬科植物，是一种药食两用天然植物，具有清热解毒、抗菌消炎、疏散风热的功效[2]。金银花中含有多种黄酮类化合物。木犀草素和忍冬苷等黄酮类化合物是金银花的主要活性成分之一，具有抗自由基、抗氧化的作用，对人体的心血管系统有保护作用，可以防止动脉硬化、降低血脂和胆固醇、改善血管的通透性等，黄酮类化合物含量可以作为综合分析该类药材的质量指标[3]。测定金银花中黄酮类化合物的含量对于金银花的研究具有重要的意义。目前黄酮类物质常见的提取方法有水提、乙醇提、超声法和酶解醇提法等[4-5]。本文采用超声波辅助乙醇提取金银花中的总黄酮，对其提取工艺进行响应面分析，得到最优提取条件，对金银花深加工产业发展提供数据参考。

目前黄酮类物质提取效率较好方法是超声辅助提取法。主要是利用超声波的空化效应破坏细胞膜，促进黄酮类化合物的释放与溶出，并且强化提取过程传质作用[6]。超声辅助提取属于物理提取方法，无化学反应发生，最大限度地保存目标提取组分的生理活性。超声辅助提取法具有操作简单、提取时间短、提取效率高、节能环保、常温提取不破坏热敏性活性成分和成本低等优点，广泛应用于中草药有效成分提取。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

金银花，购于福建省宁德旭升综合农业开发有限公司；芦丁标准品，购于中国药品生物制品检定所。

KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；L-530型离心机，湖南湘仪仪器有限公司；UV-1750型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2 金银花总黄酮得率的测定方法

以芦丁对照标准品溶液，510 nm测定各浓度标样的吸光值，绘制标准工作曲线。精密称取5 g经过干燥粉碎后一定粉碎粒度的金银花粉末于锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，用超声波清洗器在一定的功率和温度下超声一定时间，之后再将浸提液倒入离心管中，用离心机在4 000 r·min-1的条件下离心20 min，取一定量的上清液，用相应的乙醇溶液稀释一定倍数，再移取12 mL稀释液于50 mL容量瓶中，显色后分别测定其吸光度值，然后通过标准工作曲线回归方程计算各样品中黄酮的含量。金银花总黄酮的得率按公式计算：

式中：X-样品中黄酮类化合物含量，%；C-依据标准曲线计算出被测液中黄酮浓度，μg·mL-1；m-样品的质量，g；F-稀释倍数；V-待测液的总体积，mL。

1.3 单因素试验

研究超声辅助乙醇提取因素对金银花总黄酮得率的影响，主要考察金银花粉碎粒度、乙醇的浓度、提取的次数、时间、温度、料液比以及超声功率等因素对黄酮类化合物得率的影响。固定其他因素不变，进行单因素试验，单因素梯度设计如下。粉碎粒度：20目、40目、60目、80目 和100目；乙 醇 浓 度：10%、25%、40%、55%、70%、85%和100%；提取时间：10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min；提取温度：20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃；料液比（g·mL-1）：1∶10、1∶25、1∶40、1∶55、1∶70和1∶85；超声功率：120 W、150 W、180 W、210 W、240 W和270 W。

1.4 金银花总黄酮提取工艺优化

分析单因素试验结果并综合考虑，根据Box-Benhnken（BBD）原理设计试验，对金银花中总黄酮提取条件进行工艺优化和响应面分析，以期得到最佳提取工艺参数。

1.5 数据分析

采用Design-Expert数据处理软件进行试验数据处理和结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

从不同单因素试验的曲线图1～图6。A是不同粉碎粒度对金银花总黄酮得率的影响。

图1 粉碎粒度对金银花总黄酮得率的影响图

图2 乙醇浓度对金银花总黄酮得率的影响图

图3 提取时间对金银花总黄酮得率的影响图

图6 超声功率比对金银花总黄酮得率的影响图

图4 提取温度对金银花总黄酮得率的影响图

图5 提取料液比对金银花总黄酮得率的影响图

经F检验，粉碎粒度对结果影响差异显著（P＜0.05）。B是乙醇浓度对金银花总黄酮得率的影响。经F检验，乙醇浓度对结果影响差异极显著（P＜0.05）。C是提取时间对金银花总黄酮得率的影响。经F检验，提取时间对结果影响极显著（P＜0.05）。D是提取温度对金银花总黄酮得率的影响。经F检验，提取温度对结果影响有一定的显著性，但并不是很明显。E是料液比对金银花总黄酮得率的影响。经F检验，料液比对结果的影响极显著（P＜0.05）。F是超声功率对金银花总黄酮得率的影响。经F检验，超声功率对结果影响极显著（P＜0.05）。经上单因素分析粉碎粒度、提取温度对结果影响并没有特别显著，其余4个因素对结果有极显著性影响，故选择乙醇浓度、提取时间、料液比、超声功率4个因素进行后续的响应面试验设计。

2.2 超声波辅助乙醇提取金银花总黄酮最佳工艺的研究

2.2.1 BBD试验设计

根据单因素试验结果，选择乙醇浓度、提取时间、料液比和超声功率4个对金银花总黄酮得率影响显著的因素，对其提取工艺参数进行后续的响应面优化，没有显著影响的因素选取为60目粉碎粒度，提取温度保存70 ℃恒温。响应面试验水平因素如表1所示。

表1 响应面试验水平因素表

2.2.2 试验结果与分析

表2 响应面分析结果及指标预测表

续表2

2.2.3 数学模型建立及显著性检验

采用ANOVA变异系数分析响应面试验结果，其显著性检验结果如表3所示，当Prob＞F值小于0.05时，该因素才具有显著性。

采用Design-Expert处理软件，构建影响因素与总黄酮得率（Y）之间数学关系，得到方程为：

从表3的结果可以看出，提取时间和超声功率这两个因素，其Prob＞F值小于0.01（均＜0.001），说明提取时间和超声功率对黄酮提取的影响极为显著，相反乙醇浓度、料液比所对应的Prob＞F值均大于0.05，表明这两个影响不显著，整体模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明该拟合模型二次方程为极显著；失拟项比F值为0.85，不显著，说明试验数据可靠，拟合二次方程模拟的比较好，可以比较准确地应用于总黄酮提取得率的预测；方程相关系数R2为0.9以上，预测值与真实值之间相关性较好，并且其校正决定系数也是0.9以上，表明充分考虑自变量情况下，该回归方程拟合程度很高。

表3 显著性检验结果表

2.2.4 总黄酮提取最佳工艺验证试验

利用上文拟合的数学模型进行最优工艺参数预测，可得：乙醇浓度为56.64%，提取时间为40.47 min，料液比为1∶40，超声功率为150 W，此时金银花总黄酮得率最大预测值为11.48%。采用预测的最优工艺参数进行试验验证，考虑实际操作方便性，将黄酮提取工艺参数调整为：乙醇浓度为57%，提取时间为40 min，料液比为1∶40，提取功率为150 W，结果得到金银花总黄酮得率为11.41%，与模型预测值的误差为0.61%，因此可知模型预测值与试验值相近，金银花总黄酮提取工艺参数准确可靠。

2.2.5 提取工艺响应面交互试验影响效果

影响金银花提取因素之间的交互作用对总黄酮得率的影响效果如图7所示。

图7 提取因素之间的交互作用对总黄酮得率的影响图

图a显示的是在料液比为1∶40，超声功率为150 W时，乙醇浓度、提取时间对总黄酮提取得率的交互影响。从图可知，乙醇浓度、提取时间对总黄酮提取得率的交互影响情况相似，随着乙醇浓度增加或提取时间的延长，总黄酮提取得率先上升后下降。

图b所示为，当超声功率150 W、提取40 min时，乙醇浓度和料液比对总黄酮提取得率的交互影响。由图可知，当提取液乙醇浓度较低、料液比较小时，黄酮提取得率也较小，随着乙醇浓度、料液比的增加，提取得率提高，但增大到一定程度后，得率会略有下降，原因可能是提取乙醇浓度过高时，金银花中总黄酮的溶解度反而下降，而且超声时间延长，可能导致黄酮破坏和降解。因此，当乙醇浓度为56.64%、料液比为1∶40时，最有利于金银花总黄酮得率的增加。

图c显示的是在提取时间为40 min和料液比为1∶40时，乙醇浓度与超声功率对金银花总黄酮得率的影响。从中可以看出，响应值对乙醇浓度与提取功率的变化较不敏感，响应面的坡度较平。在试验范围内，金银花总黄酮的提取得率随着乙醇浓度、提取功率增大，而呈现出先增后降的趋势。因此，在一定范围内，增加乙醇浓度、超声功率有利于总黄酮得率提升。当乙醇浓度为56.64%、提取功率为150 W、提取时间为40 min、料液比为1∶40时，金银花总黄酮的得率最大。

图d显示的是在乙醇浓度55%为与超声功率为150 W时，提取时间、料液比对总黄酮提取得率的交互影响。从图可知，在一定范围内，金银花总黄酮得率随着提取时间的延长而先增后减，随着料液比的增加而先增后变化不明显。可能是因为随着提取时间延长，溶液黄酮可能被降解或者氧化，导致黄酮提取得率降低；料液比的增加，增大了物料与液体的接触面积，加速了黄酮的溶出。因此，当乙醇浓度为56.64%、提取温度为70 ℃、提取时间为40.47 min、料液比为1∶40时，金银花总黄酮的提取得率最大。

图e显示的是在乙醇浓度为55%和料液比为1∶40时，提取时间、超声功率对金银花总黄酮提取得率的交互影响。由图可知，金银花总黄酮的得率随着提取时间与提取温度的增加而先增加后减少，可能是因为长时间的高温会破坏黄酮结构或者促进其氧化转变。乙醇浓度55%、料液比1∶40、提取功率150 W、提取时间40.47 min，此条件下金银花总黄酮的提取得率达到最大。

图f显示的是在提取时间40.47 min、乙醇浓度55%时，料液比、超声功率对金银花总黄酮提取得率的交互影响。金银花总黄酮的提取得率随着料液比的增加而先增加后减少，随着提取温度上升提取得率先增加后缓慢下降。因此，当提取时间为40.47 min、乙醇浓度为55%、料液比为1∶40、超声功率为150 W时，金银花总黄酮的提取得率达到最大，最有利于黄酮的溶出。

4 结论

利用单因素试验分析和响应面优化，并经试验验证得到金银花中超声辅助乙醇提取总黄酮的最优工艺为：57%乙醇提取浓度，提取时间40 min，料液比1∶40，150 W超声功率，该工艺条件下，金银花总黄酮提取得率为11.41%，黄酮提取得率比传统提取方法有较为显著的提高。本研究为药食两用原料金银花中总黄酮高效提取和应用开发提供参考。