水貂犬瘟热病毒RT-PCR的诊断

曹志伟

（莱西市农业农村局 266600）

犬瘟热(canine distemper,CD)是一种传染性极强的烈性传染病,由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)感染引起，能使多种动物自然感染和发病，包括食肉目犬科、貂科和浣熊科，但不传染人类和猫。感染犬瘟热后，病畜以呈现双相热型、皮屑、严重的消化道障碍和呼吸道炎症等为特征，有特殊的腥臭味，偶有神经症状，发病死亡率较高[1]。

早在18世纪的后叶欧洲即有犬瘟热病毒病的存在，Carre氏于1905年发现病原为病毒。我国水貂犬瘟热首发于1968年，近年来，犬瘟热病毒不断侵染各种动物，特别是给毛皮动物养殖业带来了巨大经济损失，故称此病为毛皮动物三大疫病之一。

1 材料与方法

1.1 材料

山东省某水貂场送检的疑似犬瘟热的病死水貂2只（未接种犬瘟热疫苗），无菌采集病貂肝脏和肺脏作为病毒分离材料，分别放入已标好序号的无菌病料采集袋中，置-20℃保存。

1.2 方法

本试验采用RT-PCR扩增方法诊断犬瘟热病毒，即反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)。

1.2.1 试验处理

在GenBank中，根据已报道的CDV毒株核蛋白基因(N)序列，选择基因保守序列作为PCR扩增的靶序列，用Prinler 5.0软件分别设计1对扩增287bp的N基因引物，42℃水浴60min，反转录合成为cDNA。

1.2.2 PCR反应

将cDNA置于PCR反应体系中，用振荡器振荡混匀，将28μL体系分装入200μL的离心管，加反转录产物（模板）2.0μL，吹打，摇晃至无气泡进行反应。经过94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，反应30个循环，72℃终延伸10min等程序，靶序列被放大上万倍甚至上百万倍从而被检测出来[2]。

2 结果与分析

本试验通过凝胶电泳技术对是否有核酸片段扩增进行判断，用扩增产物的基因片段大小与目的基因片段大小进行比对，若一致，即可判定病料中含有犬瘟热病毒。

2.1 RT-PCR产物的检测（琼脂糖凝胶电泳）

2.1.1 配制琼脂糖凝胶溶液，使凝胶厚度在3～5mm之间。

2.1.2 取6μL样品的扩增产物与2μL 6×loading Buffer混合均匀，分别加入对应的加样孔中，随后，把DNA Maker加入第3孔中，作为分子量对照，1和5两孔分别加入阴性和阳性对照。

2.1.3 将凝胶放入电泳缓冲液中，采用电压120V，电流60mA，恒压电泳20min，然后放入紫外凝胶成像系统鉴定，拍照。

2.2 检测结果

凝胶电泳结果

由于犬瘟热病毒PCR扩增产物凝胶电泳片段为287bp。由此判断该貂场送检的2只水貂中有一只感染犬瘟热病毒。

3 讨论与结论

3.1 讨论

本文选择保守性较强的N基因的5’端非编码区，设计合成引物，用RT-PCR方法对犬瘟热病毒扩增出了特异性的片段大小为287bP的产物，而本试验扩增病料中片段与287bP相符，因此说明RT-PCR方法是特异的，同时该病料即被确诊为含有犬瘟热病毒。在低温条件下保存的犬瘟热病料仍能被RT-PCR方法检测出来[3]，表明了RT-PCR诊断方法具有较高敏感性，可以用于犬瘟热的临床诊断。

除具有较高敏感性外，RT-PCR诊断方法所使用的试剂容易购买，对不同疾病进行检测时，唯一的不同点在于引物设计，而所使用的试剂则几乎相同[4]。在众多的诊断方法当中，RTPCR具有非常明显的优越性，以ELISA方法为例，该方法所用到的单克隆抗体、抗血清很难购买到，也存在假阴性的问题，敏感性不佳[5]。而对于RT-PCR诊断方法而言，试验前，可以利用粪便等多种病料处理后进行RT-PCR扩增，有利于对经济动物及大型野生动物诊断，从而解决临床病例的确诊问题。

3.2 结论

通过对两只疑似犬瘟热的水貂进行犬瘟热病毒RT-PCR的诊断，一只被确诊为阳性，表明RT-PCR诊断犬瘟热具有强特异性、高敏感性，同时，取材方便、检测快速、对检测样品要求低也是RT-PCR诊断方法的一个突出的优点。本试验中RTPCR扩增以犬瘟热病毒的特定碱基序列为测目标，针对性极强，因RT-PCR方法检测的是病毒的核酸，与生物化学和免疫学相比，其检测结果与病毒分离培养结果更为一致。