复方肠泰抑制小鼠结肠癌血管生成及其机制的实验研究

刘静冰，李灵常，余佳霖，魏国利，姜子瑜，霍介格

（南京中医药大学附属中西医结合医院肿瘤科，南京 210028）

结直肠癌是我国发病率和病死率位居第一的消化系统恶性肿瘤，严重威胁居民生命安全。手术、放疗、化疗和靶向治疗是结直肠癌的重要治疗手段，中医药在其综合治疗中发挥着日益重要的作用。复方肠泰系南京中医药大学附属中西医结合医院肿瘤科治疗结肠癌的经验方，已制成院内制剂应用于临床。临床研究表明[1]：复方肠泰联合化疗显著改善肠癌患者临床症状，提高生活质量，降低癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）水平，提高T 淋巴细胞分型为代表的多项免疫指标，降低白细胞减少发生率，起到减毒增效作用。课题组前期研究发现，在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型中，复方肠泰具有显著抗新生血管生成作用[2]，故本研究以CT26.WT 结肠癌细胞小鼠移植瘤为研究对象，观察其对结肠癌新生血管生成的影响，并初步探讨其作用机制。

1 实验材料

小鼠结肠癌细胞（CT.26WT）：货号C3005，上海冠导生物有限公司。雌性ICR 小鼠：代码201，18 ～20 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司。无血清培养基（SFM）：货号17705-021，品牌Gibco，规格500 mL，南京信帆生物。BCA 蛋白定量试剂盒：产品货号KTD3001，品牌Abbkine，武汉艾美捷科技有限公司。Promega M-MLV 逆转录酶：货号M1701，品 牌 普 洛 麦 格。SYBR® Premix Ex TaqTM ：货 号DRR081A，品牌TaKaRa。VEGFR2、AKT、p-AKT、HIF-1α 和GAPDH 一抗：货号分别为#9698、#4691、#4060、#36169 和#5174，品牌Cell signaling。Antirabbit IgG，HRP-linked Antibod 二抗：货号#7074，品牌Cell signaling。复方肠泰处方：人参10 g，黄芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦参6 g，八月札10 g。加10 倍体积水浸泡30 min 后煮2 h，药渣加8 倍水再煮2 h，煎煮液100 目筛网过滤，冷却后2 次滤液经蒸发仪浓缩至220 mL，作为饮片水煎液，生药浓度2.50 g/mL。加入PBS 于离心机10 000 r/min 离心10 min后取上清液，根据不同浓度需要加入一定量的PBS 稀释，使用滤器过滤除菌，于4 ℃冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 建立小鼠结肠癌模型及分组 将小鼠结肠癌细胞CT26.WT 从液氮储存罐中复苏后，37 ℃下溶解，于RPMI 1640 培养基（含10 %的胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 U/mL 的链霉素）中稳定生长。按2 ×107/mL 的浓度在20 只ICR 小鼠皮下注射0.2 mL 细胞悬液，构建小鼠结肠癌模型。待瘤体生长至100 mm3～150 mm3随机分组，共分4 组，每组5 只。参考课题组既往实验数据[3]，对照组用生理盐水灌胃，低剂量组复方肠泰13.90 g/kg 灌胃，中剂量组复方肠泰27.80 g/kg 灌胃，高剂量组复方肠泰55.60 g/kg 灌胃。

2.2 测量转移瘤体积变化 生理盐水将复方肠泰稀释成不同浓度，小鼠每天灌胃1 次，每次0.2 mL，持续给药13 d。给药开始计为d 1，隔日记录各组小鼠移植瘤体积，先测量肿瘤体积再给药。肿瘤体积计算公式：V = 长径 × 短径2 /2。小鼠连续灌胃13 d 后处死，完整剥离肿瘤组织。

2.3 免疫组化检测转移瘤微血管密度（microvessel density, MVD） 小鼠肿瘤组织制片后使用CD34 抗体标记血管内皮，反映MVD。MVD 测定参照Weidner的微血管计数方法：首先于低倍镜（× 40）下观察全部视野，选择3 个高密度的血管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最高的区域；然后在高倍镜（× 400）下双盲法计数微血管。呈现单个或聚集在一起的数个被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞，独立于邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织，作为1个微血管计数，计数3 个视野，取其均值作为MVD。管腔大于8 个红细胞直径或管壁带有肌层的大血管不作为新生血管计数。

2.4 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 的浓度 小鼠尾静脉取血，使用ELISA 检测试剂盒检测小鼠血清内皮生长因子（VEGF）、细胞表面分化抗原44v6（CD44v6）和金属基质蛋白酶-2（MMP-2）浓度。

2.5 聚合酶链反应（RT-PCR）检测肿瘤组织VEGFR2和HIF-1α mRNA 的转录水平 使用TRIzol 试剂提取小鼠瘤组织中的总RNA，设计上下游引物扩增（引物序列见表1），取2 μg RNA 运用Promega MMLV 逆转录酶及相关试剂进行逆转录反应，反应体系为20 μL。取0.5 μL RT产物运用SYBR®Premix Ex TaqTM（TaKaRa）进行RT-PCR 反应。反应条件如下：PCR 程序设置为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 40 s 共40 个循环。GADPH 作为内参，用2-△△Ct法测定RNA 含量。

表1 目标基因的引物序列

2.6 蛋 白 印 迹（Western Blot） 检 测 肿 瘤 组 织VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 的表达 皮下移植瘤标本用PBS 洗涤后，使用超声粉碎机粉碎，于6 000 r/min 离心5 min 后提取蛋白，BCA 蛋白分析试剂盒测定蛋白含量。SDS-PAGE 凝胶电泳结束后，将蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶中封闭50 min。加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次后，室温加入二抗孵育50 min。使用ECL 发光剂与膜反应曝光，扫描捕捉蛋白条带。

2.7 统计学方法 使用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用ANOVA 分析。

3 结果

3.1 复方肠泰抑制小鼠移植瘤生长 小鼠予不同剂量复方肠泰灌胃。对照组小鼠瘤体增长迅速，复方肠泰组瘤体增长缓慢，且剂量越高增长越缓慢，呈剂量依赖性（图1）。小鼠给药结束后处死，剥离肿瘤，复方肠泰剂量越高，小鼠肿瘤体积越小（图2）。

图2 各组小鼠移植瘤剥离后体积

3.2 复方肠泰降低结肠癌组织MVD MVD 是评价肿瘤血管生成的公认指标，通过免疫组化CD34 染色，可以看到对照组染色最深，复方肠泰组不同程度染色减少，且剂量越高CD34 染色越少（图3）。说明复方肠泰具有抑制小鼠结肠癌血管生成的作用，且该抑制作用具有剂量依赖性。

图 1 小鼠移植瘤体积变化曲线

图3 小鼠移植瘤CD34 免疫组化染色强度

3.3 复方肠泰降低小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 表达 与对照组相比，随着复方肠泰剂量增加，小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平逐渐降低（见表2）。复方肠泰可抑制小鼠血清中VEGF、CD44v6和MMP-2 的表达，抑制作用与剂量有关。

表2 小鼠移植瘤VEGF、CD44v6 和MMP-2 表达 μg/L

3.4 复方肠泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 的转录 经复方肠泰处理后，小鼠移植瘤中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的mRNA 转录水平较对照组均不同程度降低，并呈剂量依赖性关系（见图4）。

图4 小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 水平

3.5 复方肠泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白表达 复方肠泰抑制小鼠移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表达，p-AKT/AKT比值显著下降，且呈现剂量依赖性（见图5）。

图5 小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 蛋白的表达

4 讨论

早在1971 年，哈佛大学医学院Folkman 教授首次提出了肿瘤生长依赖于血管生成的观点[4]，认为肿瘤细胞通过分泌促血管因子，刺激肿瘤产生新生血管，为肿瘤生长供应血液和营养，随后肿瘤血管新生被认为是肿瘤十大恶性生物学行为之一[5]。“抗肿瘤血管生成”已成为晚期恶性肿瘤的重要治疗策略，在晚期结直肠癌中尤为重要。一项在晚期结直肠癌患者中比较IFL 化疗方案联合贝伐珠单抗和单用化疗的临床研究发现[6]，联合组较对照组取得了4.7 个月的生存获益（20.3 m vs. 15.6 m），抗血管生成药物也已写入中国、美国、欧洲等众多国家和地区的结直肠癌诊疗指南中。

现代药理学研究发现，很多中药复方、中药单体以及中药注射剂也具有抗肿瘤新生血管生成的作用。活血化瘀类的桃红四物汤、血府逐瘀汤，软坚散结类的鳖甲煎丸等，均通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）发挥抗肿瘤血管生成的作用[7]。中药单体的研究则更为广泛而深入。黄芩提取物灯盏花乙素可下调VEGF，从而抑制肿瘤血管生成，其机制可能与抑制AKT 磷酸化有关[8]。人参皂苷Rg3 在体外和体内均有显著抗血管生成作用，可以抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移、黏附和小管的形成[9]；Rg3 联合索拉非尼可抑制小鼠肝移植瘤生长，其机制可能与调控血管生成相关因子HIF-1α、VEGF 和VEGFR2 相关[10]。复方肠泰组方包括人参、薏苡仁、白花蛇舌草、莪术、八月札和藤梨根六味中药，课题组前期研究发现，复方肠泰对HUVEC 的迁移、增殖和小管形成具有抑制作用，体内抑制小鼠matrigel 栓形成，因此推测其对肿瘤组织应该也有抗血管生成作用[2]。

本研究中复方肠泰显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长，降低了肿瘤组织的微血管密度。进一步检测相关细胞因子和蛋白表达，复方肠泰抑制结肠癌移植瘤小鼠血清中VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平，下调移植瘤中VEGFR2 和HIF-1α 的mRNA 转录，抑制移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表达。VEGF 在血管的新生和发展中发挥重要的调控作用，是关键的促血管生成因子，参与了肿瘤的发展、侵袭和转移，是结肠癌的重要不良预后因子[11]。MMP-2 和CD44v6与肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭密切相关，MMP-2 水平的升高促进了结肠癌细胞的转移[12]，CD44v6 在结肠癌组织中高表达且与不良预后相关[13]。HIF-1α 是缺氧环境下细胞活动的重要调控因子，缺氧时HIF-1α 被激活，它不仅使VEGF mRNA 稳定性增加，而且增加VEGF 的转录活性，刺激新生血管生成[14]。AKT 信号通路与结肠癌新生血管生成密切有关，AKT 失活可以抑制结肠癌新生血管的生成，磷酸化的AKT 蛋白p-AKT 是其主要活性形式[15]。

综上所述，本研究结果表明，复方肠泰可以抑制小鼠结肠癌移植瘤的血管生成，下调VEGF、CD44v6和MMP-2 等与血管生成相关细胞因子的表达，其作用机制可能与抑制HIF-1α 的表达和AKT 蛋白的磷酸化有关。