鸡蛋叶酸含量检测方法优化及其富集规律研究

2021-11-05李锐瑞武笑天

动物营养学报 2021年10期

白彦王瑞,2 杨玉* 李锐瑞武笑天

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.吕梁学院生命科学系，吕梁 033000)

叶酸(folate)是指一类含有蝶酰谷氨酸结构的水溶性维生素，也称为维生素B9、维生素H等，主要参与体内一碳单位代谢，与DNA合成、氨基酸转化、甲酸代谢、组氨酸分解、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成及甲基化反应等有关，是生命体必需物质之一[1]。人体内没有叶酸合成相关酶，需要通过食物或添加剂获取叶酸。富含叶酸膳食主要有绿色蔬菜、豆类食品、酵母、动物肝脏、蛋黄等[2]。鸡蛋营养丰富，氨基酸比例适合人体生理需求，是餐桌常见食物。功能性鸡蛋主要通过调节微量元素、维生素、不饱和脂肪酸等在蛋鸡饲粮中的科学配比进行饲喂而得到，其营养价值高于普通鸡蛋。其中，富叶酸鸡蛋在我国[3]及加拿大[4]、美国[5]、欧洲[6-7]等地得到广泛研究和应用，但尚未有该产品的国标或行标来规范其生产。

鸡蛋叶酸含量随饲粮中叶酸添加量的增加而增加，但并非呈线性增加，而是存在饱和期，达到饱和期的饲粮叶酸添加量为2～16 mg/kg[3-6]。不同研究人员报道的鸡蛋叶酸含量结果差异较大，普通鸡蛋叶酸含量为17.5～35.0 μg/枚，富叶酸鸡蛋为41～75 μg/枚，但总的来讲，富叶酸鸡蛋中叶酸含量为普通鸡蛋的2～3倍[3-4,6,8-10]。这种差异可能与原料类型及来源、蛋鸡品种及日龄、检测方法等有关。多数研究持续时间为3～14周[3-11]，而蛋鸡产蛋周期在50周以上；我国居民消费鸡蛋多以“个”为单位，而鸡蛋大小对全蛋叶酸含量有很大影响。因此，需要对全产蛋期鸡蛋叶酸含量进行研究。

鸡蛋中叶酸的主要形式为5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MTHF)，是人和动物体内的活性形式，且主要存在于蛋黄，蛋白中几乎没有[6,11]。食品中叶酸测定的国标法[12]规定，蛋类样品叶酸提取采用高压水解加酶解方法，检测方法采用微生物法，但整个检测过程至少需要5 d时间。酶解法是利用蛋白酶、淀粉酶等使叶酸从细胞中释放出来，随后利用大鼠血清等将多谷氨酸变成可检测的单谷氨酸或去谷氨酸形式[13-15]。酶解处理并不是对所有样品都适用，还可能会对测定结果有负面影响[16]。蛋黄中蛋白质、脂肪含量较高，超声处理可降低其粒径，增大溶解表面积，促进其溶解性[17]，是叶酸提取中常用的辅助方法。然而超声可能对叶酸结构有一定的破坏[18-19]，需要严格控制时间。蛋黄叶酸主要与蛋白质结合[20-22]，高温可以使蛋白质变性，从而使叶酸释放于提取液中[18]，然而高温可降低叶酸稳定性，需添加维生素C等进行保护[3]。微生物检测法实验室工作繁杂，标准范围较窄，重复性较差，并不能准确评估食物中叶酸含量[23]。而高效液相色谱法检测结果精确，分析速度快，操作步骤简单，分离效果理想，逐渐成为主要的检测手段[13,24]。针对叶酸检测，紫外检测器[24-25]和荧光检测器[26-29]均有使用，但针对两者性能比较的报道较少。

本试验通过比较荧光检测器和紫外检测器的性能，研究超声、高温、酶解等提取方法对蛋黄叶酸含量检测的影响，旨在优化改进基于高效液相色谱法测定鸡蛋中叶酸含量的方法。通过短期筛选试验，确定生产富叶酸鸡蛋饲粮中叶酸的适宜添加量，随后开展大群饲养的长期稳定性试验，确定鸡蛋叶酸含量到达高峰的时间及稳定性，为蛋鸡1个生物学产蛋年生产稳定的富叶酸鸡蛋提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5-MTHF(标准品)购自加拿大TRC公司；甲醇(色谱级)购自美国Fisher公司；抗坏血酸(纯度99.0%)、巯基乙醇(纯度99.0%)、蛋白酶(pepsin，1∶3 000)、大鼠血清购自北京索莱宝科技有限公司；α-淀粉酶购自上海易恩化学技术有限公司；其他用于分离的试剂均为国产分析纯；水为4.5 L规格娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪配置荧光检测器和紫外检测器以及Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)(美国安捷伦科技有限公司)、冷冻干燥机(美国GOLD-SIM公司)、恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、冷冻离心机(盐城市安信实验仪器有限公司)、组织匀浆仪(IKA T10 basic，德国IKA集团)、电子天平(BSA224S-CW，德国赛多利斯集团)。

1.3 高效液相色谱法检测蛋黄中叶酸方法优化

1.3.1 标准溶液配制

准确称取10 mg 5-MTHF标准品，用提取液[14](0.1 mol/L 磷酸盐溶液，含1%抗坏血酸、0.1%巯基乙醇，pH 6.1)溶解后定容到100 mL，配制成质量浓度为0.1 mg/mL标准品储备液，-20 ℃保存。将标准储备液稀释到0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、5.00、10.00 μg/mL后存于棕色容量瓶中，现配现用，用于绘制标准曲线。

1.3.2 高效液相色谱参考条件

柱温：35 ℃；进样体积：20 μL；流速：0.4 mL/min；流动相A：甲醇；流动相B：pH 4.5、0.03 mol/L磷酸盐缓冲液；采用梯度洗脱[27]，如表1所示。荧光检测条件：激发波长290 nm，发射波长360 nm[28]；紫外检测条件：280、290 nm[25]。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 样品准备

检测体系构建使用普通京红一号鸡蛋的蛋黄冻干粉。具体为：蛋黄分离后，用滤纸小心擦干表面蛋清，混匀，于-80 ℃冰箱冻存1 d后，上机冷冻干燥48 h(冷阱温度为-60 ℃，真空度为10 Pa)，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.4 提取方法优化

准确称取0.5 g左右同一蛋黄冻干粉样品于15 mL离心管中，加6 mL提取液，匀浆。之后以超声、高温、酶解等方法及其组合进行叶酸提取，每个处理进行6次重复，以选择适宜提取方法。超声、高温、酶解提取的具体方法如下。

超声提取：40 ℃、80 Hz。

高温提取：90 ℃水浴5 min后在冰水中冷却。

酶解提取采用“三酶法”，按文献[12,15,30]提供的方法，略有改动，具体如下：加20 mg/mL蛋白酶溶液1 mL，37 ℃水浴3 h(每隔1 h摇匀1次)，沸水浴10 min后冰水冷却至室温，加20 mg/mL淀粉酶溶液1 mL、大鼠血清0.3 mL，37 ℃水浴22 h，沸水浴10 min后冰水冷却至室温。

样品经提取处理后，用提取液定容到10 mL，12 000×g、4 ℃离心25 min后取上清液，过0.22 μm滤膜，上机检测。整个过程需要避光操作。

1.3.5 方法验证

从太谷区某超市购买白壳、粉壳和褐壳鸡蛋，乌鸡蛋等不同类型鸡蛋各10枚，将每枚鸡蛋的蛋黄分离后，立即用上述优化方法对新鲜蛋黄中叶酸进行检测。

1.4 叶酸富集规律试验设计

试验在太谷区兴民牧业有限公司进行。添加剂叶酸(纯度99.8%)为河北某生物科技有限公司生产。

试验鸡舍为半封闭式，采用阶梯式笼养模式，每笼3只蛋鸡，试验期间自由采食和饮水，每日光照16 h，强度不少于15 lx/m2。

1.4.1 适宜添加量筛选试验

采用单因素试验设计，挑选初始体重一致的健康30周龄京红一号蛋鸡648只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复18只。对照组饲喂基础饲粮(表2)，试验组在基础饲粮中分别添加1、3、6、12、24 mg/kg叶酸。第5周最后1天每个重复随机取10枚鸡蛋，将其蛋黄混匀于-80 ℃冰箱保存，进行叶酸含量检测。

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表2项目 Items含量 Content营养水平 Nutrient levels3)代谢能 ME/(MJ/kg)11.08粗蛋白质 CP16.46粗纤维 CF3.00粗脂肪 EE2.89粗灰分 Ash12.61钙 Ca3.51总磷 TP0.50有效磷 AP0.22赖氨酸 Lys0.78蛋氨酸 Met0.39蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.66苏氨酸 Thr0.58叶酸 Folate/(mg/kg)0.35

1.4.2 富叶酸鸡蛋叶酸含量的长期稳定性研究

根据1.4.1结果，选择16 000羽蛋鸡舍，从20周龄起，在蛋鸡饲粮中添加7.5 mg/kg叶酸，至60周龄。在鸡舍内选择10个监测点，兼顾鸡舍上、下，前、后，南、北等。分别于20、21、22、23、24、25、27、29、33、37、41、46、50、55、60周龄09:00—10:00，每个检测点取10枚鸡蛋，称重后，分离蛋黄与蛋清，蛋黄称重混匀后立即进行叶酸含量检测。

1.5 数据与分析

数据使用SPSS 26.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法进行组间多重比较和差异显著性分析。方法优化数据以平均值和标准差表示，叶酸富集数据以平均值和总体标准误表示。回归分析以叶酸添加量为变量，全蛋叶酸含量为因变量，进行线性、二次、三次等曲线估算。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。用GraphPad Prism 8进行绘图。

2 结果与分析

2.1 检测器性能比较与选择

以标准液叶酸含量为横坐标(X)，所对应荧光检测器、紫外检测器峰面积(重复进样3次的平均值)为纵坐标(Y)分别进行标准曲线绘制。将浓度为0.10 μg/mL的标准溶液，按1.3.2中的色谱条件测试3次，信噪比为10∶1时的相应浓度为定量限(LOQ)，信噪比为3:1时的相应浓度为检出限(LOD)。按照1.3.2中色谱条件，连续10 d，每天检测1次1 μg/mL标准液，记录峰面积、峰高、半峰宽，比较检测器检测结果的稳定性，如表3所示。结果显示，在0～10 μg/mL，荧光检测器、紫外检测器280 nm和紫外检测器290 nm这三者所得标准曲线的相关系数均达到0.999。荧光检测器峰面积和峰高均极显著高于紫外检测器(P<0.01)，约是紫外检测器的3.5倍。紫外检测器在290 nm时峰面积极显著高于在280 nm时(P<0.01)，两者峰高无显著性差异(P>0.05)。三者半峰宽无显著差异(P>0.05)。荧光检测器的检出限和定量限远低于紫外检测器，表明其灵敏度更高。后续试验选用荧光检测器。

2.2 提取方法对检测结果的影响

由表4可知，样品匀浆后未进行任何处理和采用B提取方法未检出蛋黄叶酸。只对C～G提取方法进行分析，结果显示：蛋黄叶酸含量检测值以D提取方法最高，C提取方法次之，再次为E提取方法，F和G提取方法最低。C和D提取方法的检测值显著高于F和G提取方法(P<0.05)。后续试验选用D提取方法，即超声5 min后90 ℃水浴5 min进行蛋黄叶酸提取，随后及时检测。5-MTHF标准品和蛋黄样品色谱图如图1所示。

表3 检测器性能比较

表4 提取方法对检测结果的影响

图1 5-MTHF标准品和蛋黄样品色谱图

2.3 精密度、回收率和稳定性

用2.1和2.2中确定的方法，检测同一蛋黄冻干粉样品中叶酸含量，并在样品中加1 μg 5-MTHF标准品，进行回收率测定，重复测定8次，结果如表5所示。样品回收率平均为98.01%，相对标准偏差(RSD)为4.42%，同一样品检测结果RSD为2.15%。上述结果表明优化的检测方法精密度和回收率均能满足检测要求。

表5 精密度与回收率试验

由于样品处理与检测不能完全同步，随后进行了稳定性试验。样品提取后立即检测(0 d)以及1、2 d(4 ℃保存)后进行检测，每次3个重复。由表6可知，连续3 d的检测结果差异很小，稳定性较高。

表6 稳定性试验

2.4 方法验证

对市场常见的鸡蛋类型蛋黄叶酸含量进行检测，用于验证方法可行性，结果如表7所示。

2.5 鸡蛋中叶酸富集规律

由表8可知，蛋鸡饲粮中添加叶酸1～24 mg/kg可以极显著提高蛋黄和全蛋叶酸含量(P<0.01)，但并非随着饲粮叶酸添加量的增加而直线上升，在6～12 mg/kg组达到最高值后，在24 mg/kg组呈现下降的趋势。本试验中，叶酸添加量为3～24 mg/kg的4个组的蛋黄叶酸及全蛋叶酸含量无显著差异(P>0.05)，但6 mg/kg组全蛋叶酸含量比3 mg/kg组提高8.5%，与12 mg/kg组差异很小，考虑到生产成本问题，需在理论上估测生产富叶酸鸡蛋的蛋鸡饲粮叶酸适宜添加量。

对全蛋叶酸含量进行回归分析，结果如表9所示。结果显示，在0～24 mg/kg叶酸添加量范围内，全蛋叶酸含量对饲粮叶酸添加量的响应呈二次和三次曲线变化，且三次曲线的决定系数高于二次曲线，因此选择三次曲线的回归模型计算鸡蛋中叶酸富集量最高时对应的蛋鸡饲粮叶酸添加量，确定7.5 mg/kg为适宜添加量。

表7 常见蛋类叶酸含量

2.6 富叶酸鸡蛋在蛋鸡产蛋期叶酸含量稳定性

从20周龄产蛋开始，在基础饲粮中添加叶酸7.5 mg/kg，至60周龄，定期检测鸡蛋叶酸含量，测定结果如图2所示。结果显示，蛋黄叶酸含量在23周龄趋于稳定，在25周龄达到最高值，在25～60周龄，蛋黄叶酸含量有较小波动，且随着日龄增加，略有下降，但整体保持在5 μg/g以上。全蛋叶酸含量随着日龄的增加而增加，在33周龄以后，蛋重和蛋黄重增加幅度较小，全蛋叶酸含量基本稳定，即每个鸡蛋可提供85 μg以上的叶酸。

表8 饲粮中添加叶酸对鸡蛋叶酸含量的影响

表9 全蛋叶酸含量与饲粮叶酸添加量的回归模型

图2 生产周期内富叶酸鸡蛋蛋重、蛋黄重及叶酸含量

3 讨论

3.1 检测条件及提取方法的优化

叶酸本身具有荧光性[14]，不需要任何衍生方法即可用荧光检测器进行检测，具备更低的检测限[16]，干扰峰较少[27]。叶酸在紫外210～300 nm均有吸收，在280[24]和290 nm[25]峰形较好、检测灵敏度高。本试验中，荧光检测器在检出限、定量限、峰型等方面均优于紫外检测器。试验过程中，蛋黄样品检测液中叶酸含量在0.125 μg/mL以上，远高于荧光检测器的定量限，满足检测要求。

对蛋黄样品只进行超声处理时不能达到检出限，表明超声处理虽然能够使提取液与样品更好地接触，但不能释放叶酸。本试验中，超声10 min后高温提取的检测结果低于超声5 min，表明超声可能对叶酸结构有一定的破坏[18-19]，因此需要严格控制超声时间。酶解处理也能释放叶酸，而本试验中酶解处理后的检测结果显著低于高温处理，可能与样品中干扰物质有关，使叶酸没有完全释放[16]，也可能与处理时间较长使少量叶酸氧化降解有关。

Hoey等[6]利用微生物法测得鸡蛋中叶酸含量为0.60 μg/g，折合到1个鸡蛋(蛋重50～70 g)为30～40 μg；Jastrebova等[31]利用高效液相色谱法测得蛋黄中叶酸含量为2.26 μg/g，折合到1个鸡蛋(蛋黄重15～20 g)为35～45 μg/枚；梁敏慧[15]利用液质联用(LC-MS)法测得鸡蛋中叶酸含量为0.823 μg/g，折合到1个鸡蛋为41～57 μg；杨艳[3]利用LC-MS法测得鸡蛋中叶酸含量约为36 μg/枚。本试验利用优化的方法测得不同类型鸡蛋中叶酸含量有差异，可能与蛋鸡品种、饲粮组成、叶酸添加等有关，但总体在39～49 μg/枚，与前人研究结果基本一致，说明方法可行。此方法准确性高，与国标法[12]相比，操作简单，检测时间缩短。

3.2 生产富叶酸鸡蛋饲粮叶酸适宜添加量及生产周期内鸡蛋叶酸含量的稳定性

饲粮中添加的叶酸经肠道吸收后，在肠上皮细胞经二氢叶酸还原酶的作用转化为四氢叶酸后经门静脉进入肝脏，转化为各种形式参与机体物质代谢，其中5-MTHF从肝细胞进入血液后，随血液循环到机体各个组织器官发挥重要作用。5-MTHF转运至鸡卵巢后，经胞吞作用进入卵黄而达到富集作用[2]。已有研究显示，鸡蛋中叶酸含量随着饲粮中叶酸添加量的增加而增加，但到达一定量后不再增加[3-8,11]，与本试验结果一致。叶酸在肠道吸收受到限制可能是导致鸡蛋中叶酸含量存在平台期的一个因素[32]。不同品种蛋鸡对叶酸的敏感度可能不同。白莱航鸡饲粮中添加2 mg/kg叶酸时，蛋黄叶酸含量达到饱和[5]；海兰W36、海兰W98、海兰CV20生产富叶酸鸡蛋时，饲粮中叶酸适宜添加量均为4 mg/kg[3-4,33]；海兰褐蛋鸡饲粮中添加16 mg/kg叶酸时鸡蛋叶酸含量最高，且达到平台期[6]。本试验以京红蛋鸡为研究对象，蛋黄叶酸含量在饲粮叶酸添加量为3 mg/kg时趋于饱和，在叶酸添加量为6 mg/kg时达到最高。但为追求最大生产效益，根据统计学分析结果，选择7.5 mg/kg作为生产富叶酸鸡蛋的饲粮叶酸适宜添加量。蛋黄自形成到从卵巢排出需要10 d左右，因而蛋黄中叶酸富集并达到平衡需要一定时间。Hoey等[6]研究显示，饲粮添加叶酸第3周，鸡蛋叶酸含量达到饱和；Dickson等[33]研究表明，蛋鸡高峰期(25～28周龄)饲喂添加4 mg/kg叶酸饲粮4周后，全蛋及蛋黄叶酸含量达到最高值，随后每8周进行1次检测(共5次)的结果差异较小，与本试验结果基本一致。33周龄后每枚鸡蛋可提供叶酸85 μg以上，根据国家卫生健康委员会推荐的居民膳食营养素参考摄入量[34]计算，可满足幼儿至正常成人叶酸推荐量的50%～20%。