黑麦草对Cd-Zn复合胁迫的响应

白哲， 董馨岚， 李铭红

(1.浙江师范大学 行知学院，浙江 金华 321004； 2.浙江师范大学 生态研究所，浙江 金华 321000)

镉(Cd)作为植物生长发育非必需元素，是目前重金属污染中面积分布最广、危害性最强的重金属元素之一。环境中Cd浓度过高，会使植株矮小、生长迟缓，严重时甚至导致植株死亡[1]。且Cd极易被植物吸收累积进入食物链，对人类健康产生威胁[2]。Zn是植物生长发育的必需元素，具有调节光合作用、促进植物生长的重要功能，植物生理屏障对Zn具有一定抵抗力[3]，但Zn过量会导致植物代谢失衡，叶绿素合成受破坏，造成缺铁性失绿及生长发育障碍。土壤中重金属来源途径多样，且污染源并非单独存在，通常是多种污染成分共存，产生综合作用；Cd和Zn在元素周期表中均属于ⅡB族元素，化学性质相似，因此，二者总是在自然界相伴而生，造成土壤重金属复合污染[4]。

植物修复技术因其治理成本低廉、环境美学兼容、治理过程原位三大特性，成为重金属土壤污染修复研究热点[5]。植物可通过自身解毒机制，使重金属在土壤中的浓度下降，从而使土壤被重新使用。黑麦草是一年生或多年生草本植物，生物量较大，易于种植，不仅对多种重金属有较强的耐性和抗性，且对重金属具有富集能力[6]。

徐卫红等[7]研究发现，土壤中高浓度Zn、Cd共存时，黑麦草对Zn、Cd的吸收为协同效应，且植株吸收的重金属Zn、Cd主要集中在地上部。目前，黑麦草受Cd、Zn污染的研究主要集中于单一元素，而关于Cd-Zn复合胁迫机理的研究仍较少。为了阐释重金属Cd-Zn复合胁迫对黑麦草的影响及黑麦草重金属富集能力，本研究在Cd、Zn单一污染预实验的基础上，设置不同浓度梯度的Cd-Zn复合污染处理栽培试验，检测黑麦草幼苗生长、生理生化指标变化情况，并结合植物对重金属的富集和转移能力，探讨黑麦草对Cd-Zn复合污染土壤的修复潜力，为寻找适宜修复Cd-Zn污染土壤的牧草提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑麦草种子购于金华市花卉苗木市场。土壤采自浙江师范大学农田试验基地，取地表20 cm深度土壤，去除石块、植物根系等杂质后置于阴凉通风处自然风干后备用。土壤pH值为6.8，有机质含量5.13 g·kg-1，全氮含量0.72 g·kg-1，速效磷含量18.6 mg·kg-1，速效钾含量203.1 mg·kg-1，全Cd含量2.58 mg·kg-1，全Zn含量56.73 mg·kg-1。用分析纯的CdCl2·2.5H2O和ZnSO4·7H2O配制成不同浓度梯度的重金属溶液，与土壤充分混匀，静置钝化2周后作为供试土壤。

1.2 处理设计

根据相关文献和我国土壤环境质量标准[8-9]，并且结合前期Cd、Zn单一污染对黑麦草种子萌发及幼苗影响的试验结果，本研究中对重金属Cd、Zn质量比的上限作适当延伸，分别选取土壤Cd浓度为10(A1)、50(A2)、100(A3)mg·kg-1；Zn浓度为100(B1)、400(B2)、800(B3)mg·kg-1；进行Cd和Zn二因子正交试验设计，对照组CK(不加外源Cd和Zn)，每个处理3个重复。

黑麦草种子用70%乙醇灭菌3 min，去离子水冲洗后用滤纸吸干水分备用。试验所用的花盆高15 cm，直径20 cm，每盆装土1 kg，播种50粒颗粒饱满、大小均匀的种子。根据土壤水分状况，每天或隔天浇等量去离子水，保证土壤持水量在70%左右，并将渗出溶液反复回收浇灌，使Cd、Zn浓度保持在设定水平。生长过程中，及时清除盆栽中其他杂草。试验60 d后采集植株及根部土样，进行生长发育指标、生理指标及吸收富集特征指标测定。

1.3 样品处理与指标测定

完成植物生长周期后，取植物样品先用自来水充分淋洗，再用0.1 mol·L-1稀盐酸洗净，最后用去离子水冲洗2～3次，并用滤纸吸干表面水分。将植株地上部与根部分开，105 ℃下杀青30 min，90 ℃下烘干至恒重称量干重。同时取植物根部土壤，自然风干后，研磨至粉末状后过100目筛待测。

选取植物样品测定生理指标：叶绿素含量采用95%乙醇提取法[10]测定；叶绿素荧光参数采用便携式脉冲调制叶绿素荧光仪(PAM-210)测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[10]测定；细胞膜透性采用电导仪法测定。植物样品采用HNO3-HClO4法消解；土壤样品采用HCl-HNO3-HClO4法消解。采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(Inductively Coupledd Plasma-Atomic Emission Spectrometry，ICP-AES)测定植物与土壤中Cd、Zn的含量。

1.4 数据处理与分析

富集系数(bioconcentration factor，BCF)=植物体内重金属含量/土壤中重金属含量。

转运系数(transfer coefficient，TF)=植物地上部重金属含量/根系重金属含量。

采用Excel 2010进行数据处理，采用SPSS 20.0进行方差分析及最小显著差异性检验(LSD法)，采用Origin 8作图。

2 结果与分析

2.1 Cd-Zn复合胁迫对黑麦草生长指标的影响

在同一Cd浓度时，黑麦草地上部长度及根系长度随着重金属Zn浓度增加而呈下降趋势(表1)。在A3B3处理下，Cd-Zn复合污染对地上部长度及根系长度的抑制作用最明显，较CK组分别降低74.67%和82.80%，差异显著。

表1 Cd-Zn复合胁迫下黑麦草的生长指标

植物生物量能够反映植物在胁迫环境中的耐受性和适应性[11]。由表1可知，黑麦草地上部生物量基本表现为A1>A2>A3。在A3B3处理下，黑麦草地上部生物量达到最小值，较CK组显著降低92.63%。Cd-Zn污染条件下，黑麦草根系生物量均低于CK组，但差异未达到显著水平，其中在A3B3处理时达到最小值，较CK组降低91.99%。

2.2 Cd-Zn复合胁迫对黑麦草生理指标的影响

叶绿素是光合作用的主要色素，其含量高低直接反映植株光合作用水平的强弱，可以作为植物抗逆性评价的一项重要指标[12-13]。高Cd浓度(A3)污染下，黑麦草叶绿素含量均低于CK组，且在A3B1时达到最小值，与CK组差异显著，抑制效应最强，较CK组下降33.97%。叶绿素荧光参数包含PSⅡ反应中心光合量子转换和光化学效率两部分，它们可以通过叶绿素荧光参数波动来反应植物光合强度及生长状态[14]。Cd-Zn复合污染条件下，黑麦草最大光化学效率(Fv/Fm)与潜在光化学效率(Fv/Fo)均受到抑制。在A1、A3处理的Cd浓度下，Fv/Fm与Fv/Fo随着Zn浓度上升抑制作用逐渐增强，均在A3B3处理下达到最小值，较CK组分别显著降低30.15%和57.31%(表2)。

表2 Cd-Zn复合胁迫下黑麦草的生理指标

脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，脯氨酸含量是反映植物对外界环境重金属胁迫响应的重要指标之一[15]。在中高Cd浓度(A2、A3)时，随着土壤中Zn浓度增加，黑麦草脯氨酸含量均在B3处理时受到更强的促进作用，且在A3B3处理时叶片脯氨酸含量达到峰值，较CK组显著增加231.16%(表2)。表明高浓度Zn能显著促进黑麦草脯氨酸累积，以此减轻或避免重金属对黑麦草的伤害。

细胞膜系统是植物细胞和外界环境进行物质交换和信息交流的界面和屏障，其稳定性是细胞进行正常生理功能的基础[16]，重金属胁迫可以破坏细胞膜的稳定性，导致细胞膜透性增加。在各复合污染处理中，除A1B1处理组外，黑麦草细胞膜透性均较CK组呈现不同程度的增强。在低Cd浓度(A1)时，黑麦草的细胞膜透性随着Zn浓度上升而增大，A1B3较CK组增加86.76%；在中Cd浓度(A2)时，细胞膜透性较CK组显著提高，在A2B3处理下增长最多，为133.76%。

2.3 Cd-Zn复合胁迫对黑麦草富集效果的影响

2.3.1 复合胁迫对Cd富集的影响

在植物对重金属复合污染土壤修复潜力的研究中，重金属累积含量能够很大程度上反映植物的修复效果。随着土壤Cd、Zn污染程度的加剧，黑麦草地上部及根系中Cd含量均呈逐步增加的趋势(图1)。通常植物对重金属的吸收具有就近积累效应，即重金属含量由高到低为为根>茎>叶，本试验中黑麦草Cd含量也表现为根系>地上部。Cd-Zn复合污染下，黑麦草地上部和根系Cd含量在中高Cd浓度(A2、A3)处理时与CK组呈现显著差异。在高Cd浓度(A3)时，黑麦草地上部及根系对Cd的累积随Zn浓度增加而升高，且在A3B3达到峰值，较CK组分别增加96.06%、98.25%。可以发现，黑麦草地上部及根系Cd富集在Cd-Zn复合胁迫下表现出相近的变化规律，在高浓度Cd处理下土壤中Zn含量的增加，会促进黑麦草地上部及根系对Cd的吸收。

柱间无相同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。图2～3同。

2.3.2 复合胁迫对Zn富集含量的影响

Cd-Zn复合污染下，Zn在黑麦草地上部、根系富集情况表明，除A1B1根部外，黑麦草地上部及根系Zn含量均显著高于CK组(图2)。植物不同部位对Zn的吸收能力存在差异，黑麦草地上部对Zn的富集在中、高浓度(B2、B3)时得以表现，而黑麦草根系则在低浓度(B1)处理下就富集重金属。这说明相较于地上部，黑麦草根系对重金属的富集能力更强，且Cd、Zn间存在协同效应，增加重金属Cd浓度会促进黑麦草吸收Zn。

黑麦草地上部在中、高Zn浓度(B2、B3)时，Zn富集含量随着Cd浓度增加而升高，组内组间均表现出显著差异；而根系对Zn的吸收在低Zn浓度(B1)下就表现出协同效应，说明黑麦草根系对Zn的吸收能力更强，且Cd含量增加会促进黑麦草吸收Zn。在A3B3处理时，黑麦草地上部及根系Zn富集含量均达到峰值，较CK组分别升高94.67%、92.32%。在植物体内，天然存在的Zn含量在1～160 mg·kg-1。由图2可知，在重金属Cd-Zn复合污染土壤条件下，黑麦草地上部、根系的Zn含量均超出天然存在范围，说明黑麦草对Zn的吸收能力较强。

图2 Cd-Zn复合胁迫下黑麦草地上部及根系Zn含量

2.3.3 复合胁迫对Cd、Zn富集系数的影响

富集系数可用来衡量植物对重金属的吸收和富集能力，富集系数越大，表明植物吸收重金属的能力越强，对修复土壤污染越有利。在Cd-Zn复合胁迫下，黑麦草Cd富集系数大于Zn，表明黑麦草对Cd的富集能力大于Zn，Cd更容易被黑麦草吸收(图3)。低、中Cd浓度(A1、A2)时，黑麦草地上部及根系Cd富集系数随Zn含量增加而降低，说明添加Zn会抑制黑麦草对Cd的吸收；高Cd浓度(A3)则有所增加。黑麦草地上部及根系对Cd的富集系数均在A2B1处理组达到峰值，分别为2.48、6.91。根系对Cd的富集系数除A1B3处理外，其余均大于1，可知黑麦草地下部具有强富集能力，属于Cd根际富集植物。除A1B1处理组，黑麦草Zn富集系数表现为根系>地上部，说明黑麦草根系对Zn具有较强的富集能力。相同Zn浓度处理下，黑麦草地上部及根系Zn富集系数随Cd浓度增加呈上升趋势，且均在A3B3处理时达到最大，分别为2.21和2.64。

图3 Cd-Zn复合胁迫下黑麦草对Cd、Zn的富集系数

2.3.4 复合胁迫对Cd、Zn转运系数的影响

转运系数反应植物将吸收的重金属从根系转移到地上部的能力。黑麦草在Cd-Zn复合污染下对Cd转运系数均低于1，在A1B2处理时对Cd转运系数最高，达0.94，说明Cd在黑麦草地上部分转运能力低，根系固定能力强(图4)。而黑麦草在低浓度(A1B1)污染条件下，对Zn转运系数大于1，为1.64，说明黑麦草在该污染条件下能较容易地从根系向地上部转移重金属Zn。

处理组合间无相同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

3 讨论

当重金属污染程度超过植株耐受范围，会对植株的生理代谢和营养吸收等产生毒害，通常表现为抑制植物幼苗生长，促进植物坏死[17]。本试验表明，Cd-Zn复合胁迫下，黑麦草地上部及根系生长受到显著抑制；且黑麦草生物量随Cd和Zn浓度升高而下降，均在A3B3处理下达到最小值，这与侯琪琪[8]的研究结果一致，可能是土壤中Cd、Zn浓度超过了黑麦草的耐受限度，从而影响黑麦草幼苗的生长、细胞分裂及多种代谢活动。

逆境条件会对植物生理代谢产生影响，试验表明Cd-Zn复合污染下，黑麦草体内叶绿素含量、叶绿素荧光参数、脯氨酸含量及细胞膜透性均受到不同程度影响。本试验显示，高浓度Cd-Zn复合污染下黑麦草叶绿素含量显著低于CK组，可能是由于重金属毒害使叶绿体结构和功能遭受破坏，抑制了叶绿体片层中捕光复合体合成，同时使叶绿体相关酶活性受到抑制，阻碍了叶绿素的合成[15,18]。叶绿素荧光是检测逆境对植物PSⅡ反应中心损伤程度的灵敏探针，可以反映重金属对光合作用整体机构的胁迫程度[19]。本试验中，黑麦草受重金属Cd-Zn胁迫，Fv/Fm与Fv/Fo均低于CK组，说明重金属Cd、Zn对黑麦草光合作用整体机制产生抑制作用，这与Rau等[20]的结论相似。重金属胁迫会打破植物细胞中活性氧与自由基的平衡，导致细胞膜结构受到破坏，此时植物细胞通过分泌大量脯氨酸等逆境保护物质来缓解重金属伤害。本研究发现，在重金属Cd-Zn复合胁迫下，黑麦草中脯氨酸含量随着重金属浓度升高而增加，在A3B3处理时达到峰值，较CK组显著增加69.80%。Cd-Zn胁迫下黑麦草细胞膜透性较CK组表现出不同程度的增大，这与王友保等[21]在Cu污染环境中对高羊茅细胞膜透性的分析类似，均是由于重金属对植物的毒害作用造成电导率升高与细胞膜系统破坏所致。

相关研究[22]表明，Cd、Zn之间的交互作用因土壤理化性质、植物种类、组织部位及重金属浓度而异。潘秀等[23]研究发现，Cd-Zn交互作用影响互花米草中重金属的积累，无论地上部或根部，添加Zn都促进植物吸收重金属Cd。也有试验[7]证明，Cd、Zn的协同效应与环境中重金属的浓度相关，当环境中Cd、Zn浓度差异较大时，黑麦草对Cd、Zn的吸收表现为相互抑制；而当环境中Cd、Zn浓度均高时，黑麦草对Cd、Zn的吸收表现为协同效应。本试验也得到相似结论，黑麦草对Cd、Zn的富集均在高浓度处理下出现协同作用，即在镉(锌)浓度保持不变时增加锌(镉)能促进植物对镉(锌)的富集；且均在高浓度(A3B3)Cd-Zn联合处理下，黑麦草地上部及根系对重金属Cd、Zn吸收达到峰值。以上结果表明，重金属元素之间的交互作用复杂多样，关于黑麦草对Cd、Zn交互作用的具体机理还需进一步阐明。

富集系数、转运系数是评价不同植物对土壤重金属富集、转运能力的重要指标，可以判断植物对土壤的修复效果。本研究中黑麦草对Cd、Zn富集系数结果显示，在Cd-Zn复合污染的土壤中，黑麦草对重金属Cd富集系数大于Zn，随复合重金属污染浓度升高，Cd、Zn富集系数都呈现出上升趋势，这与姜礅等[24]在研究银中杨对Cd、Zn、Pb富集特性的结论相似。张尧等[25]研究指出，黑麦草能够有效富集土壤中的Cd，且富集的Cd主要积累在根部。本试验也得出类似结论，黑麦草在Cd-Zn复合胁迫下，根部富集系数大于地上部富集系数，可能是由于在植物对重金属的耐受机制中，根系通常能释放单糖、氨基酸等多种对有毒重金属起固定作用的有机化合物[26]。转运系数反映植物将吸收的重金属从根系转移到地上部的能力，转运系数越大，重金属由根系向地上部的转运能力越强。Clemens[27]认为，根系吸收的Cd主要通过木质部运输到地上部，其运输效率取决于根系细胞壁和液泡对Cd吸收、固定以及根部细胞间共质体通道的运输效率，根系对重金属转移能力的高低还与木质部的装载能力有关。本研究表明，黑麦草对于Cd-Zn复合污染土壤具有良好的修复效果，在中、高浓度下，随着重金属浓度增加，黑麦草对重金属的转运系数增大。这可能是由于重金属胁迫浓度增加，黑麦草细胞壁和液泡对重金属吸收、固定能力降低，使更多重金属进入木质部中，导致运往地上部的Cd、Zn含量增加，最终引起转运系数呈增加的趋势。

综合考虑植物生长、生理及富集各项指标，Cd-Zn复合胁迫对黑麦草幼苗生长的抑制作用随重金属浓度升高而增强，叶绿素含量和最大光化学效率则在高浓度复合污染土壤中表现出显著差异。此外，在高浓度Cd-Zn复合胁迫下，黑麦草可以通过调整自身的某些机能来抵抗重金属胁迫的损害，使植株生长不受强烈Cd、Zn胁迫的影响，表现出较强耐性。Cd-Zn复合胁迫条件下，黑麦草吸收重金属Cd、Zn能力均为根系>地上部，且当环境中重金属浓度较高时，黑麦草对Cd、Zn的吸收呈协同效应。黑麦草还具有生长迅速、分蘖力强、年收多茬、生物量大等优势，因此，可以作为修复重金属污染土壤的新材料，尤其可能对Cd-Zn复合污染土壤的修复效果更好。