HPLC-DAD法同时测定正柴胡饮颗粒中9个活性成分的含量

刘 明，尹 强，赵 雷，高晶德

（1. 大连市第三人民医院药剂科，辽宁 大连 116000；2. 大连市友谊医院药剂科，辽宁 大连116000；3. 大连市第六人民医院药剂科，辽宁 大连 116000；4. 大连市第七人民医院药剂科；辽宁 大连 116000）

正柴胡饮颗粒是由柴胡、陈皮、防风、甘草、赤芍和生姜6味药材制备而成的中药制剂，具有发散风寒，解热止痛之功效。临床常用于外感风寒所致的发热恶寒、无汗、头痛、流感初起等症[1]。柴胡具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气的作用[2]；陈皮具有理气健脾，燥湿化痰的作用[3]；防风主治外感风寒、周身疼痛、头痛目眩、风寒湿痹、骨节疼痛等证[4]；赤芍具有清热凉血、散瘀止痛、清泻肝火等作用[5]；甘草主要有益气补中、祛痰止咳、清热解毒、调和诸药等作用[6]。正柴胡饮颗粒收载于中国药典2020年版一部，质量标准仅对赤芍的有效成分进行质量控制[1]，相关文献对其他几味药材中有效成分质量控制的报道较少，且涉及药材较单一[7-9]。本研究以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷为指标成分，建立一种简便、准确、可行的HPLC法同时测定正柴胡饮颗粒中上述9个成分含量的方法，为完善正柴胡饮颗粒质量标准提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器

LC2030C3D高效液相色谱仪（日本岛津），DAD检测器；Agilent TC-C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；XSR225型十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多）；H66MC超声清洗机（无锡超声电子设备有限公司）；Milli-Q Reference超纯水系统（美国默克密理博）。

1.2 材料

正柴胡饮颗粒（中国中医科学院实验药厂，规格：10 g/袋，批号：20190506，20191121，20190808）；正柴胡饮颗粒（精华制药集团股份有限公司，规格：10 g/袋，批号：4112326，4112420，4112411）；柴胡皂苷a对照品（批号：110778-201912，纯度：94.8 %）、柴胡皂苷d对照品（批号：110778-201912，纯度：96.3 %）、橙皮苷对照品（批号：110721-201818，纯度：96.2 %）、升麻素苷对照品（批号：111522-201913，纯度：94.6 %）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号：111523-201811，纯度：97.4 %）、甘草苷对照品（批号：110726-201819，纯度：99.8 %）、甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，纯度：96.2 %）、甘草次酸对照品（批号：110723-201715，纯度：99.6 %）、芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度：95.1 %）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、甘草苷、甘草次酸和甘草酸铵对照品适量，置入100 ml量瓶，加甲醇溶解制成每1 ml含橙皮苷211.1 μg、芍药苷465.7 μg、甘草苷288.3 μg、升麻素苷148.7 μg、甘草酸铵194.4 μg、甘草次酸90.7 μg、柴胡皂苷a 123.5 μg、柴胡皂苷d 81.7 μg和5-O-甲基维斯阿米醇苷84.4 μg混合对照品储备液。精密量取储备液5 ml置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 正柴胡饮颗粒适量，研细，称取约0.5 g，精密称定，置入50 ml量瓶，加入甲醇约30 ml，超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）20 min后取出，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按照正柴胡饮颗粒的处方比例，分别制备缺柴胡、陈皮、防风、甘草和赤芍的阴性样品，并按“2.1.2”方法，分别制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）- 0.02 %甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，25 %→47 %A；10～22 min，47 %→65 %A；22～45 min，65 %→33 %A；45～53 min，33 %A→25 %A；53～70 min，25 %A），流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；检测波长采用波长切换法（0～7 min，283 nm；7～13 min，230 nm；13～38 min，254 nm；38～56 min，210 nm；56～70 min，254 nm）。

2.3 专属性试验

在上述色谱条件下，分别测定对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液。结果对照品溶液基线平稳，9个指标成分分离良好；供试品溶液在柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷相应色谱峰保留时间处均有检出，各色谱峰理论塔板数均＞4000，色谱图详见图1。

图1 专属性试验高效液相色谱图

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品储备液0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10.0 ml，分别置入50 ml量瓶，加甲醇溶液定容，在“2.2”项色谱条件下进样分析，记录色谱图。以各成分峰面积（Y）对各成分质量浓度（X，μg/ml）绘制标准曲线，计算回归方程。同时逐级稀释混合对照品溶液，以信噪比不小于10确定定量限。9个指标成分的回归方程、线性范围、相关系数及定量限见表1。

表1 9个指标成分的回归方程、线性范围和相关系数

2.5 精密度试验

2.5.1 仪器精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷峰面积的RSD分别为0.59 %，1.07 %，0.66 %，1.17 %，0.43 %，1.22 %，0.80 %，1.14 %，0.94 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.2 中间精密度试验 另一名检验人员使用Waters2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），按“2.1”项下方法分别制备对照品溶液及6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷的RSD均小于2.0 %（n=6）。同时计算两名检验人员间12份样品溶液中9种活性成分含量的RSD值，分别为1.77 %，1.85 %，1.69 %，1.64 %，1.42 %，1.71 %，1.54 %，1.69 %，1.29 %（n=12）。表明本方法中间精密度良好。

2.6 重复性试验

取正柴胡饮颗粒（批号：4112326），按“2.1.2”项下的制备方法平行制备6份溶液，在“2.2”项色谱条件下进样分析并计算各成分含量及其RSD值。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷的平均含量分别为1.3241，0.8477，2.2701，1.5264，0.8567，3.0415，2.0073，0.9546和4.8562 mg/g，RSD分别1.30 %，0.87 %，0.69 %，1.44 %，1.03 %，1.17 %，1.31 %，1.66 %，0.49 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取正柴胡饮颗粒（批号：4112326）按“2.1.2”项下的制备方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，16，24 h在“2.2”项色谱条件下进样测定，记录峰面积。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷峰面积的RSD分别为1.36 %，0.94 %，1.52 %，0.81 %，1.51 %，1.23 %，0.75 %，1.14 %，1.49 % （n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量样品6份（样品批号：4112326），每份约0.25 g，精密称定，分别置50 ml量瓶中，精密加入“2.1.1”项下混合对照品储备液2.5 ml，按“2.2.2”项下方法制备溶液，在“2.2”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，计算回收率。结果见表2。

表2 9个成分的加样回收率（n=6）

表2（续）

2.9 样品测定

取各批次正柴胡饮颗粒样品适量，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算各批次样品中9个指标成分的含量，结果见表3。

表3 正柴胡饮颗粒中9个指标成分的含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 指标成分的选择

现代药理研究表明[2-6]，柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d、陈皮中的橙皮苷、防风中的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷、赤芍中的芍药苷、甘草中的甘草苷、甘草酸铵和甘草次酸是各药材中主要活性成分，且《中华人民共和国药典》2020年版一部收载的柴胡、陈皮、防风、甘草和赤芍分别以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷作为指标成分对药材质量进行控制[1]。

3.2 色谱条件的考察

采用DAD检测器在190～400 nm全波长扫描光谱图，发现芍药苷、甘草苷的最大吸收在233 nm附近，橙皮苷最大吸收在281 nm附近，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵、甘草次酸最大吸收在257 nm附近，柴胡皂苷a、柴胡皂苷最大吸收在208 nm附近。笔者参考各药材标准中含量测定项下各成分的检测波长，最终采用波长切换法，在0～10 min检测波长为283 nm（检测橙皮苷），10～20 min检测波长为230 nm（检测芍药苷和甘草苷），20～45 min检测波长为254 nm（检测升麻素苷、甘草酸铵和甘草次酸），45～62 min检测波长为210 nm（检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d），62～70 min检测波长为254 nm（检测5-O-甲基维斯阿米醇苷）。考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈与不同浓度的甲酸、磷酸水溶液的流动相体系[10-14]。结果，乙腈的洗脱能力优于甲醇，故选择乙腈作为流动相中的有机相；以乙腈-0.02 %甲酸水溶液作为流动相时基线平稳，可有效改善升麻素苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的拖尾现象，提高待测成分与相邻色谱峰的分离度。

试验考察了Agilent TC-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Thermo Accucore C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和Kromasil C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）对色谱峰的影响，结果表明，9种活性成分均能完全分离且峰型较好，其中Agilent TC-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）效果最佳，表明本试验方法对色谱柱的选取范围较广。考察了不同柱温（25～35 ℃）对色谱峰的影响，结果表明，柱温25 ℃时，各色谱峰峰型最佳。考察了不同流速（0.8～1.2 ml/min）对色谱峰的影响，结果1.0 ml/min时，各色谱峰的出峰时间和峰型最佳。以上考察表明，本方法耐用性较好。

3.3 小结

结果显示，9个指标成分为两个厂家不同批次正柴胡饮颗粒的共有成分，6批样品中的含量最高的是芍药苷，均符合《中华人民共和国药典》2020年版标准。本实验建立了 HPLC-DAD 法同时测定正柴胡饮颗粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸和芍药苷9个活性成分的分析方法，方法简便、准确，重复性好，为正柴胡饮颗粒的质量研究提供了更加全面的方法。