黄樟素型沉水樟茎段组织培养研究黄樟素型沉水樟茎段组织培养研究

肖祖飞，魏 希，张北红，王颜波，李 凤，姜 睿，彭 艺，金志农

(南昌工程学院，江西省樟树繁育与开发利用工程研究中心 江西南昌 330099)

沉水樟 (Cinnamomummicranthum)为樟科樟属常绿乔木，主要分布在浙江、江西、湖南、台湾、广西等省份[1]。沉水樟干形通直、高大雄伟、枝叶繁茂，是优良的造林和绿化树种。沉水樟木材纹理细致，具有芳香，是船舶、高档家具等的原材料。沉水樟枝叶富含精油，枝叶精油主成分为黄樟素的为黄樟素型沉水樟(Cinnamomummicranthumct. safrole)，是重要的医药原料。由于长期对沉水樟资源的人为破坏，目前沉水樟处于濒危状态，为国家三级重点保护植物[2-3]。沉水樟的繁殖可采用种子繁殖、扦插和组织培养[4-6]。有研究表明，沉水樟雌雄花发育成熟期不一致，因而结实率很低、难以采集到种子，且种子空壳率高，种子繁殖困难[2]。扦插繁殖又因资源少，较难获得穗条，且扦插成活率低，生根难等因素，制约沉水樟苗木的繁殖。组织培养具有操作简单、繁殖速度快、不受季节影响、可周年生产、脱毒、保持木本优良性状等优点，是苗木快繁的重要方式。目前，关于沉水樟的组织培养研究较少，翟晓巧等[7]以沉水樟幼嫩茎段为材料，筛选了IBA与BA、IAA与BA、NAA与BA对茎段芽诱导的影响；罗坤水等[6]对沉水樟茎段的初代、继代和生根培养基进行筛选；陈碧华等[8]在翟晓巧、罗坤水等研究基础上对沉水樟茎段的初代、继代、生根培养基进行改良，同时研究了组培苗的移栽技术，为沉水樟的组织培养奠定了基础。本文以黄樟素型沉水樟一年生半木质化枝条为材料，研究外植体的采集时间、消毒时间和生长调节剂对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响，以期为黄樟素型沉水樟的苗木快繁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为黄樟素型沉水樟2年生扦插苗一年生半木质化枝条，剪切成带1～2个芽的茎段(1.5～3 cm)，用自来水冲洗2 h，置于超净工作台，用体积分数75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～5次，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的采集时间对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

分别在2020年5月、7月和9月份，利用上述处理好的外植体，用质量浓度0.1%的升汞(HgCl2)消毒6 min，接种在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培养基上，每瓶1个茎段，30瓶，3次生物重复。接种30 d，统计外植体的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.2 消毒时间对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

2020年5月中旬，利用上述处理好的外植体，用质量浓度0.1%HgCl2消毒，消毒处理时间分别为3、5、7和9 min，之后接种在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培养基上，每瓶1个茎段，30瓶，3次生物重复。接种30 d，统计茎段的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.3 生长调节剂对黄樟素型沉水樟茎段萌芽诱导培养的影响

2020年5月中旬，利用上述处理好的外植体，用质量浓度0.1%的HgCl2消毒6 min，分别接种到不同诱导培养基：(1)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.2 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.4 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.8 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.15 mg/L IBA + 1.6 mg/L 6-BA，(5)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.30 mg/L IBA，(6)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.45 mg/L IBA，(7)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.60 mg/L IBA。每个处理30瓶，每瓶1个茎段。接种30 d，统计茎段的萌芽率。

1.2.4 生长调节剂对黄樟素型沉水樟组培苗增殖培养的影响

将株高3～5 cm的无菌苗修剪成约1.5 cm长的茎段(至少带有一叶一芽)，分别接种到不同增殖培养基：(1)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.25 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.50 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.10 mg/L IBA + 1.00 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.10 mg/L IBA + 2.00 mg/L 6-BA，(5)MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L IBA，(6)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.20 mg/L 6-BA，(7)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.40 mg/L 6-BA。每个处理20瓶，每瓶6～7个茎段。继代培养30 d，统计增殖芽数、株高、茎粗。

1.2.5 生长调节剂对黄樟素型沉水樟组培苗生根培养研究

挑选株高3～5 cm的无菌苗接种于生根培养基：(1)1/2 MS + 0.5 mg/L IBA，(2)1/2 MS + 1.0 mg/L IBA，(3)1/2 MS + 1.5 mg/L IBA，(4)1/2 MS + 2.0 mg/L IBA，(5)1/2 MS + 0.5 mg/L NAA，(6)1/2 MS + 1.0 mg/L NAA，(7)1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，(8)1/2 MS + 2.0 mg/L NAA。每瓶接种7～10株，组培苗生根培养25 d后统计生根率、根数、根长和根粗。

1.2.6 黄樟素型沉水樟生根苗的炼苗和移栽技术研究

生根培养11～15 d，将组培生根苗移至透光率25%～30%、温度25～30 ℃的大棚内炼苗7～10 d，将组培苗移出瓶外，用自来水清洗干净生根苗根部培养基，待移栽。移栽前将生根苗用质量浓度0.5%多菌灵消毒10～15 min，以红壤土和草木灰(体积比5∶1)为基质，之后移入装满基质的无纺布袋中央，保持基质湿润，移栽两个月后统计移栽成活率。

1.2.7 组培苗培养条件

培养基均添加蔗糖30 g/L、琼脂粉7.0 g/L，生根培养添加2 g/L活性炭，pH5.8。组培苗培养条件为光照3000～5000 lx、白质光、光照时间12 h/d、温度(25 ± 2)℃。

1.3 数据统计与方法

株高、根长用米尺测量、根粗用游标卡尺测定。采用Excel2010软件进行数据的录入、整理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 外植体的采集时间对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

由表1可知，外植体的污染率和褐化率随采集时间的推后而显著升高，萌芽率随采集时间的推后显著降低。5月份采集外植体进行组织培养，外植体的萌芽率最高，为51.80%，而污染率和褐化率最低，分别为18.95%和9.62%。与5月份比较，9月份采集外植体进行组织培养，外植体的污染率和褐化率分别提高了42.72%和10.55%，萌芽率降低了36.54%。

表1 外植体采集时间对黄樟素型沉水樟茎段培养的影响 %

2.2 消毒时间对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

由表2可知，外植体的污染率随HgCl2的消毒时间的增加而降低，褐化率随消毒时间的增加而逐渐升高，萌芽率随消毒时间的增加而先升后降。消毒3 min，外植体的污染率达到62.81%，显著高于消毒5、7、9 min，外植体的污染率最低的是消毒9 min。消毒9 min，外植体的褐化率达到58.15%，显著高于消毒7、5、3 min；消毒3 min和5 min，外植体的褐化率低，分别为10.82%和15.33%。消毒5 min，外植体的萌芽率最高，为52.59%，显著高于消毒3、7、9 min。因此，5月份采集黄樟素型沉水樟一年生半木质化枝条，用质量浓度0.1%HgCl2消毒，消毒最佳时间是5 min。

表2 消毒时间对黄樟素型沉水樟茎段培养的影响

2.3 生长调节剂对黄樟素型沉水樟茎段萌芽诱导培养的影响

由表3可知，IBA浓度为0.15 mg/L时，茎段的萌芽率随着6-BA浓度的增加呈先增后降的趋势。当6-BA浓度为0.8 mg/L时，茎段的萌芽率达到最高，为66.67%，茎段的萌芽率最低的是0.15 mg/L IBA处理，仅为16.67%。当6-BA浓度为0.8 mg/L时，茎段的萌芽率随着IBA浓度的升高而逐渐降低。0.15 mg/L IBA处理，茎段的萌芽率最高。因此，黄樟素型沉水樟茎段萌芽的最适培养基为MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA。

表3 生长调节剂配比对黄樟素型沉水樟茎段萌芽诱导培养的影响

2.4 生长调节剂对黄樟素型沉水樟组培苗增殖培养的影响

由表4可知，当IBA浓度为0.10 mg/L时，组培苗的增殖系数随6-BA浓度的增加而先增后降。6-BA浓度为1.00 mg/L时，增殖系数最大，为3.94，与2.00 mg/L 6-BA处理差异不显著，显著高于0.50 mg/L和0.25 mg/L 6-BA处理。当6-BA浓度为1.00 mg/L时，组培苗的增殖系数随IBA浓度的增加而先增后降，IBA浓度为0.10 mg/L，增殖系数最大。IBA有利于组培苗株高的生长，组培苗的株高随着IBA浓度的增加而逐渐增大。组培苗的茎粗受6-BA和IBA影响不明显，各处理组培苗的茎粗差异不显著。因此，黄樟素型沉水樟组培苗最适增殖培养基为MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L IBA。

表4 生长调节剂配比对黄樟素型沉水樟组培苗增殖培养的影响

2.5 黄樟素型沉水樟组培苗生根研究

2.5.1 黄樟素型沉水樟组培苗生根过程基部形态变化

组培苗生根培养1～5 d，基部形态变化不明显；生根培养7 d时，少部分组培苗基部膨大、切口愈合，有少量愈伤组织出现；生根培养9 d时，大部分组培苗基部膨大、切口愈合，部分组培苗基部有凸起点；生根培养11 d时，组培苗基部出现不定根(图1)。

注：a、b、c、d、e、f图分别为生根培养1、3、5、7、9和11 d。图1 1.0 mg/L IBA诱导黄樟素型沉水樟组培苗生根过程

2.5.2 生长调节剂对黄樟素型沉水樟组培苗生根的影响

由表5可知，生根率随IBA浓度的增加而先升后降。1.0 mg/L IBA处理时，组培苗的生根率最高，为79.33%，其次是1.5 mg/L IBA处理，二者之间差异不显著，组培苗的生根率最低的是0.5 mg/L IBA处理。1.0 mg/L IBA处理时，组培苗的根数也最多，显著高于其它处理，组培苗的根数最少的是0.5 mg/L IBA处理。1.5 mg/L IBA处理，组培苗的根长最大，其次是1.0 mg/L IBA处理，组培苗的根长最小的是0.5 mg/L IBA处理。IBA浓度对组培苗的根粗影响不明显，各处理间组培苗的根粗差异不显著。

表5 IBA对黄樟素型沉水樟组培苗生根的影响

由表6可知，NAA对黄樟素型沉水樟组培苗生根也有显著的促进作用，生根率随NAA浓度的增加而先升后降。1.5 mg/L NAA处理时，组培苗的生根率最高，为81.60%，显著高于0.5mg/L和 1.0 mg/L NAA处理，稍高于2.0 mg/L NAA处理。根数的变化趋势与生根率相似，1.5 mg/L和2.0 mg/L NAA处理，组培苗的根数分别为3.17和3.06，二者差异不显著，显著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA处理。2.0 mg/L NAA处理，组培苗的根长最大，为5.42 cm，其次1.5 mg/L NAA处理，二者差异不显著，显著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA处理。NAA对组培苗的根粗影响不明显，各处理间组培苗的根粗差异不显著。综合组培苗的生根率、根数、根长和根粗指标，黄樟素型沉水樟组培苗生根最适培养基为1/2 MS + 1.5 mg/L NAA。

表6 NAA对黄樟素型沉水樟组培苗生根的影响

2.6 黄樟素型沉水樟生根苗的移栽和苗期管理

组培苗生根培养11～15 d，移至温室大棚，控制棚内温度25～30 ℃、透光率20%～35%，炼苗7～10 d。将生根苗移出瓶外，清洗干净生根苗根部的培养基。移栽前用质量浓度0.5%多菌灵消毒10～15 min，之后将生根苗移入装有基质的无纺布袋，移栽后20 d 内保持空气湿度90%以上，基质保持湿润，见干即浇，每次要浇透，移栽成活率可达90%(图2)。之后依据苗木长势施用水肥，待苗木木质化，株高20～30 cm，可将苗木移入大田定植。

图2 黄樟素型沉水樟组培移栽苗

3 讨论与结论

3.1 外植体的采集时间和消毒时间对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

不同时间采集外植体，外植体的生理状态、组织幼嫩程度、内部营养物质等差异较大，影响外植体的成活率。有研究表明，5月份采集猴樟一年生半木质化枝条进行茎段组织培养，茎段的萌芽率显著高于7月份和9月份[9]，也有研究表明，2～3月份采集接种材料，外植体的污染率低，无菌活体获得率高[10]。本研究表明，与7月和9月份相比较，5月份更适合采集黄樟素型沉水樟茎段进行组织培养。究其原因可能是因为5月份新抽枝条处于半木质化状态，组织幼嫩、生长旺盛、内部营养物质丰富、新陈代谢旺盛、表面病菌少，因而外植体成活率高。

外植体消毒常用试剂有升汞、次氯酸钠、酒精等，其中升汞消毒效果最好，一般使用质量浓度为0.1%。外植体的消毒时间因不同植物、采集时间、采集部位等而异。消毒时间太短，外植体消毒不彻底，污染率高；消毒时间过长，容易杀死外植体细胞，导致褐化率提高，成活率降低。有研究表明，质量浓度0.1%的升汞消毒7 min，香樟茎段的污染率较低，回绿时间较短，萌芽率高[11]。以体积分数10%的84消毒液处理油樟茎段15 min或体积分数15%的84消毒液处理油樟茎段10 min，油樟茎段的污染率小于15%，成活率大于70%[12]。本研究表明，5月份采集黄樟素型沉水樟半木质带芽茎段，用质量浓度0.1%的HgCl2消毒5 min，茎段的污染率和褐化率较低，萌芽率最高，这可能是因为半木质化枝条本身带病菌少、容易消毒，半木质化枝条组织幼嫩、细胞分裂能力强，容易成活。

3.2 植物生长调节剂对黄樟素型沉水樟茎段组织培养的影响

植物生长调节剂在植物组织培养过程发挥重要作用。有研究表明，细胞分裂素和生长素二者的浓度配比适当的情况下才能在樟树茎段腋芽诱导、丛生芽的增殖、生根时获得较好效果[13-14]。本研究表明，6-BA、IBA、6-BA/IBA在黄樟素型沉水樟茎段的萌芽、组培苗的增值和生根过程中起重要作用。在IBA浓度不变情况下，黄樟素型沉水樟茎段的萌芽率随6-BA浓度的增加而先增后降；在6-BA浓度不变情况下，黄樟素型沉水樟茎段的萌芽率随IBA浓度的增加而降低。黄樟素型沉水樟茎段的萌芽率随6-BA/IBA的比值的升高而先升后降。6-BA和IBA的比值为1.33时，茎段的萌芽率仅为16.67%；6-BA和IBA的比值为5.33时，茎段的萌芽率达到最大，为66.67%，之后萌芽率降低。6-BA、IBA、6-BA/IBA对黄樟素型沉水樟组培苗的增殖影响与茎段萌芽率相似。6-BA和IBA的比值为10时，增殖系数最大，达到3.94。IBA和NAA对黄樟素型沉水樟组培苗的生根有显著促进作用，且NAA对组培苗的生根效果优于IBA。组培苗生根培养11d，基部出现不定根，生根适宜培养基为1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，生根率为81.60%。

3.3 黄樟素型沉水樟组培生根苗移栽和炼苗研究

组培苗的移栽成活率直接关系到组培技术是否成功。组培苗从培养室到外界，温度、湿度、光照等发生较大变化，需在有条件设施的地方炼苗一段时间才能移栽。有研究表明，黄樟组培苗炼苗3～5 d，采用泥炭土和珍珠岩混合基质，适当遮光覆膜，黄樟组培苗移栽成活率高达85%[15]。沉水樟生根组培苗瓶内炼苗20～30 d，茎干成深绿色，可移栽到瓶外，采用1/3 椰糠 + 2/3 泥炭土作基质，移栽后25 d内注意控制温度和湿度，组培苗移栽成活率可达80%以上[6]。本研究表明，黄樟素型沉水樟组培苗生根培养11 ～15 d，将组培生根苗移至透光率25%～30%、温度25～30 ℃的大棚内炼苗7～10 d，可将生根组培苗移栽到瓶外，移栽20 d内保持湿度90%以上，移栽成活率可达90%。待苗木茎木质化，株高15～20 cm，可将苗木移入大田定植。