超声波辅助—酶法提取积雪草总苷及其抗肿瘤作用研究

沈 春 陈 文 王湘君 杜长臻 苏利兴 林凌彬 杨顺雨海南热带海洋学院理学院 海南热带海洋学院水产与生命学院

查阅相关大量文献可知，积雪草在众多天然药物中作为一种具有特殊研究意义的药物，它有着和其他中药相同的良好药性，在自身优点方面，积雪草总苷的药性偏凉，具有清热解毒的功效，最重要的是它的副作用非常小，这点是很多同类药物都不具备的，且积雪草中的其他多类成分也有着不同的药效，这就使得它在药物研究这一方面具有很高的地位以及研究价值。本文拟用超声波辅助-酶法来提取积雪草总苷，利用超声波辅助-酶法的提取优点，获取积雪草总苷的最佳提取生产工艺。同时，为了充分了解其在药理方面的作用，对积雪草总苷的抗肿瘤作用也进行了相关研究分析。

1 前言

积雪草，伞形科积雪草属的干燥全草，主要分布于陕西、四川、云南、海南等多个省区，生长环境要求极低，生性十分强健，而且繁殖速度也非常快，因此它的易获取性也就不言而喻；积雪草在我国的中药史上出现的很早，到如今它的很多中药用途都被前人总结出来，发现它外用和内用皆可。主要用于腹泻、中暑、解毒、消肿以及跌打损伤等多种常见病症的治疗，用药范围十分广泛[1-3]。积雪草总苷作为积雪草多个主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化以及抗抑郁和一定程度上改善人智力的显著功效[4-5]；在现代医学不断地发展和完善的进程中，积雪草总苷的多种提取方法也不断地出现，而且其纯化方法也逐渐成熟，所以对积雪草总苷的提取工艺以及抗肿瘤机制进行相对研究，有利于它的药用价值的提升，同时也为积雪草总苷的潜在价值开发提供理论性参考。

2 积雪草总苷的研究现状

积雪草由于其各种特性，在天然药物的研究中已成为一项研究热点，而且在现代临床医学中的应用也普及的十分广泛。癌症问题在多种疾病问题中名列前茅，成为医学界的一大难点，因此对积雪草总苷的提取纯化工艺与抗肿瘤研究的相关文献也如雨后春笋般出现。刘友平[6]等以静态饱和吸附量和洗脱率为参照标准，比较不同种类的大孔树脂分离和纯化积雪草总苷，再对积雪草总苷的洗脱率等作为指标，筛选出最佳树脂吸附工艺。李涛[7]等先进行单因素试验，以提取方法为试验变量，确定积雪草总苷的最佳提取方法为超声法，再通过正交实验对影响积雪草苷提取率的四种影响因素进行实验统计分析得出最优提取工艺条件。杜建平[8]总结出各种影响成丸的因素，并结合动物体的内外胃粘膜表面实验和体外释放度两种测试结果，以最佳处方研制出具有缓释功能的积雪草总苷素丸，而且产率也十分可观，为积雪草总苷向产药的方向发展提供了很大的依据以及相关方法。

3 积雪草总苷的提取方法比较及纯化工艺

现如今积雪草总苷的提取方法有酶法、热回流法、水煎煮法、超临界萃取法、闪式提取法等多种有效提取方法。酶提取法是天然药物中最常见的提取方法之一，但酶法提取要求较高，ph要求极为严谨精细，有时用单一酶又不能达到较好的结果，必须多种酶同时作用，且用完的酶不能回收，使得提取剂浪费较为严重。该法通过酶破坏细胞壁使细胞中所需成分溶于溶剂中，达到提取目的。但不足之处是提取过程中细胞内的蛋白质等其他有效成分也会随之溢出；热回流法的过程中成分易被破坏，而且效率也不能达到期望值，产率较低；水煎煮法虽操作过程简单，且易得到所需产物，但提取的成分杂质较多，包含多种其他成分，使最终产物达不到提取标准；超临界萃取法萃取率很高且其萃取流体非一次性，可循环使用，但操作过程却极其复杂，所需设备十分昂贵，耗资过多，而且反应中的条件难以控制，易在实验过程中产生较大的误差性；闪式提取法具有成本不高，提取率高，操作性较强等多种优点，但操作危险[9-11]。因此，总结各种提取方法的优缺点，本文则采用超声波辅助-酶法来提取积雪草总苷，将超声波法用于辅助酶法，弥补酶法的缺点。超波辅助-酶法首先需进行单因素实验，比较各种酶的作用，发现纤维素酶提取效果最明显，因而在积雪草中加入一定量的纤维素酶来破坏积雪草的细胞壁及细胞膜，使有效成分易溶出到提取液中，并在不同的料液比中加入相对浓度的乙醇进行水浴回流加热，超声提取出提取液并离心。再进行正交实验比较酶解温度和用量、料液比、超声提取时间对积雪草苷提取率的影响大小关系，最终确定最佳提取工艺并提取出积雪草总苷这种所需成分。积雪草总苷的常用纯化工艺包括树脂吸附法、壳聚糖絮凝法[12]。大孔树脂广泛运用于各种天然药物的成分的分离纯化，种类较多，提取成分在纯化时可选择性高，有效成分间的比例及种类可充分的保留。

4 积雪草总苷的抗肿瘤作用

近些年来，恶性肿瘤致死率在众多病症中稳居首位，患病率更是快速升高，在天然药物中寻求和开发抗肿瘤作用的药物成分，一直是整个医学界乃至整个社会的焦点和方向。淋巴细胞产生的赘生物细胞群就会形成肿瘤，积雪草总苷是在不影响正常运行的淋巴细胞的前提下，通过抑制肿瘤细胞的增殖起到抗肿瘤的作用。周[13]等以人的胃癌细胞和肝癌细胞等癌症细胞株作为实验瘤株，用MTT法检测这些瘤株的增殖速度受积雪草总苷的影响程度，以及运用流式细胞仪，免疫印迹法等各种医疗器械和医疗手段研究积雪草总苷对肿瘤细胞的周期和凋亡的影响，发现对肿瘤细胞的增殖有着抑制作用。姚锦英[14]利用A459细胞建立裸鼠荷瘤细胞模型并利用HE染色法等一系列实验和方法，对比模型组发现积雪草总苷不仅能抑制肿瘤细胞的生长还可以令其部分坏死而起到抗肿瘤作用。

5 结语

综上所述，对积雪草总苷的特殊药理作用及提取方法有了一定的了解，它在未来医学上的作用和开发的潜力是毋容置疑的；因此，对积雪草总苷更深层次的研究是必要的，既可以加速突破现有的相关理论范围，也为后续开发和投入临床的进程奠定基础。本实验选择超声波辅助-酶法，通过超声波以机械手断优先将细胞壁破碎，加快物质运动分子的运动速率和频率，使溶剂的渗透性增加，再利用酶对细胞壁进行二次降解，两者有效结合促进积雪草总苷的溶出效率，达到实验目的；整个实验过程耗时少，最终的提取率也比较可观，实验结果数据可以为后续研究积雪草总苷的提取提供参考。