血清miR-486-5p联合 CA19-9在可切除和交界性可切除胰腺癌中的预测价值

张 一， 张巍巍， 谢方瑜， 李文利， 姜大磊， 贾孝娟， 付来琳， 王 尧，陈 斌， 宋 敏， 纪莉莎， 解祥军

1 青岛大学附属青岛市市立医院 a.消化内科， b.心内科， c.肝胆外科， d.内窥镜室，山东 青岛 266011； 2大连医科大学， 辽宁 大连 116044

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是全球癌症死亡第七大原因[1]，目前手术仍是PC患者的主要治疗选择，仅约20%的患者可手术切除，晚期生存期不超过12个月[2-3]。交界性可切除胰腺癌(borderline resectable pancreatic cancer，BR-PC)是介于可切除与不可切除之间的一个分期，将约1/3的不可切除PC纳入交界性可切除PC后而达到术后切缘阴性(R0)，从而使患者获益[4]。微小RNA(miRNA)在血液循环中具有高度稳定性，且PC具有独特miRNA表达谱[5]。本研究旨在探讨血清miR-486-5p联合CA19-9对评估PC可手术性的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年9月—2020年12月青岛市市立医院确诊的PC患者60例(其中可切除PC 21例、交界性可切除PC 11例，为可手术组;不可切除PC 28例为不可手术组)，年龄(60.65±9.22)岁；良性疾病对照组30例(包括慢性胰腺炎15例、导管内乳头状黏液瘤7例和胰腺囊肿8例)，年龄(59.50±10.52)岁；健康对照组44例，年龄(60.23±9.01)岁。收集PC患者年龄、性别、肿瘤大小、位置、淋巴转移和远处转移情况。

1.2 PC患者纳入标准 根据NCCN PC诊治指南[6]，Ⅰ～Ⅱ期为可切除PC，交界性可切除PC的判定标准为满足以下任何一项或多项：肿瘤侵犯肝总动脉但未累及腹腔干；侵犯肠系膜上动脉半周以下；侵犯肠系膜上静脉、门静脉或两者交界处，但能进行血管切除和重建；单纯侵犯肠系膜上静脉或门静脉。可切除PC和经新辅助化疗后手术达到切缘阴性的交界性可切除PC患者，根据术后标本、病理结果结合影像学检查评估肿瘤大小、分期及淋巴转移；不可切除PC通过CT、MRI、PET-CT等影像学检查以及转移性疾病的活检确诊和分期。排除无法进行临床评价肿瘤大小、分期、淋巴转移及远处转移的不可切除患者。所有受试者均在接受手术、放疗或化疗前采集血清样本。

1.3 实验方法

1.3.1 血清制备 对所有受试者采空腹全血5 ml，4 ℃，3000 r/min，离心5 min，取上层血清置于冻存管内并于-80 ℃冰箱内保存至使用。

1.3.2 RNA提取 每份样品取200 μL，采用TRNzol总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取RNA，使用NanoDrop®ND-2000分光光度计(Thermo fisher)测定RNA浓度和纯度。

1.3.3 逆转录反应 使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(复能基因，货号：QP013)和miRNA-486-5p引物(GENEWIZ公司)进行反转录合成的互补DNA[Poly(A)加尾法]。反应条件为：37 ℃ 60 min，37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，终止反应，于4 ℃保存备用。miRNA-486-5p引物序列：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGAGCTGCCC-3′，反向5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6序列：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 实时荧光PCR测定 使用荧光定量PCR仪(ABI 7500型)进行实时定量测定。PCR循环条件：30 s 95 ℃预变性，5 s 95 ℃、34 s 60 ℃共40个循环。以U6作为内参。并且根据real time PCR原始检测结果，按照2-△△ct计算相对定量。所有反应均一式三份进行，实验操作均严格按产品制造商说明书进行。

1.3.5 血清CA19-9的水平检测 采用酶联免疫吸附法测定CA19-9的水平，试剂盒购自 Roche(上海)公司。

1.4 伦理学审查 本研究获得青岛市市立医院伦理委员会批准，批号： 2021临审字第018号。所有患者均签署知情同意书。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。不符合正态分布的计量资料以M(P25～P75)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用GraphPad Prism8.0软件绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)，利用二元logistic回归公式，计算得出联合miR-486-5p和CA19-9的预测概率值，通过MedCale 15.2.2进行Z检验比较各组AUC间的差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清中miR-486-5p的表达水平 采用qRT-PCR检测134例受试者血清miR-486-5p，并计算相对表达量。可手术组和不可手术组血清miR-486-5p的表达均高于胰腺良性疾病组和健康对照组，且不可手术组miR-486-5p的表达显著高于可手术组，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

表1 各组血清miR-486-5p水平比较

2.2 PC组血清miR-486-5p的表达与临床病理参数的关系 以miR-486-5p中位表达作为参照，分为低表达组和高表达组。结果显示，在TNM分期、有无淋巴转移和有无远处转移中miR-486-5p的低表达和高表达差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

2.3 血清miR-486-5p联合CA19-9对PC可手术性的预测价值 miR-486-5p和CA19-9单独检测的预测能力相似(P>0.05)。但两者联合在胰腺良性疾病和健康人群中区分可手术PC的诊断价值优于CA19-9(Z值分别为2.510、2.841，P值分别为0.012、0.005)(表3，图1～2)。在区分可手术组和不可手术组中，两者联合的诊断价值优于miR-486-5p和CA19-9(Z值分别为2.069、2.387，P值分别为0.039、0.017)(表3，图3)。区分可手术组与良性疾病组、区分可手术组与健康对照组以及区分可手术组与不可手术组miR-486-5p的临界值分别为1.447、1.08和3.39；联合CA19-9后分别为3.12、3.21和6.63。

表2 PC血清miR-486-5p与临床特征的关系

表3 miR-486-5p、CA19-9和联合后对

图1 区分可手术组和良性疾病组的ROC曲线

图2 区分可手术组和健康对照组的ROC曲线

图3 区分可手术组和不可手术组的ROC曲线

3 讨论

PC早期诊断困难，5年相对存活率仅为9%[7-8]。新辅助治疗可缩小肿瘤体积从而达到切缘阴性[9]。可切除PC患者经治疗后5年生存率为2.8%～31.4%，不可切除的患者为0.6%～3.8%，早期手术切除后可延长2年生存期[10]。CA19-9对有症状的患者诊断敏感度为79%～81%，特异度为82%～90%[11]，但部分Lewis表型阴性者CA19-9呈假阴性，而在一些消化道肿瘤、良性胆道梗阻或特发性肺纤维化患者中可能为假阳性[12-13]。因此，急需要性价比更高的循环生物标志物预测可手术的PC，从而改善预后。

miRNA是一类长18～25个核苷酸(nt)的短单链非编码RNA[14]，调节约30%的人类基因[15]。miRNAs的表达与癌症的类型、肿瘤分期和药物治疗反应相关[16]，经广泛研究可作为多种肿瘤的潜在生物标志物。miR-486位于染色体8q11的sAnk1区域，与多种肿瘤的发生和发展相关[17]。Xu等[18]研究了PC患者血浆中671种miRNAs，发现29个异常表达，其中miR-486-5p表达上调。李兆申团队[19]发现CircNFIB1过表达可以通过miR-486-5p轴抑制PC的淋巴结转移，敲除miR-486-5p可增强5-氟尿嘧啶对PANC-1细胞迁移和侵袭的抑制作用。更有趣的是，在部分消化道肿瘤(如食管癌[17]、结肠癌[20]、肝癌[21]等)中miR-486-5p表达下调，这有利于鉴别PC与其他消化道肿瘤。上述研究表明了miR-486/miR-486-5p是PC的癌基因，且与PC的侵袭和转移有关，猜测miR-486-5p可能作为预测PC可切除性的标志物。

本研究结果显示，PC中血清miR-486-5p相对定量明显高于良性疾病组和健康对照组，这与以往研究结果一致，提示在PC血清中，miR-486-5p表达可能上调，有作为PC诊断标志物的潜力。另外，不可手术组miR-486-5p表达明显高于可手术组，表明miR-486-5p可能用于预测PC的可切除性。Mees等[22]研究证明，在高侵袭性和转移性PC组织中，miR-486以CD40作为靶点表达明显上调，且许多miRNAs可稳定的从原发肿瘤释放到血液循环中[23]。本研究进一步证实，随TNM分期越晚miR-486-5p表达越高，且与淋巴转移和远处转移相关。基于上述发现，本研究利用ROC曲线评估miR-486-5p对PC可切除性的预测价值，结果显示，miR-486-5p 和CA19-9预测能力相似，但在胰腺良性疾病和健康人群中预测可手术PC的敏感度和特异度优于CA19-9。联合miR-486-5p与CA19-9的预测价值、特异度和敏感度均优于CA19-9，同时，能更好区分可手术和不可手术PC。提示miR-486-5p可作为PC的补偿性血清生物标志物，联合CA19-9预测可切除和交界可切除PC的临床应用价值更高。本研究缺点在于样本量较小，未来需要扩大样本量且多中心实验进一步验证。

综上所述，本研究结果表明血清miR-486-5p在PC患者中表达上调，miR-486-5p联合CA19-9能进一步诊断PC的可切除性。目前缺乏研究循环miR-486-5p对可切除和交界性可切除PC诊断价值的文献，而血清检测是临床最佳非侵袭性检测方式，miR-486-5p可能成为预测PC可切除性的无创性生物标志物。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：张一负责课题设计，资料分析，撰写论文；张巍巍、谢方瑜、贾孝娟、付来琳、王尧参与收集数据，修改论文；张巍巍、谢方瑜、李文利、姜大磊负责拟定写作思路；陈斌、宋敏、纪莉莎负责修改论文；解祥军指导撰写文章并最后定稿。