流式荧光免疫法检测原发性胆汁性胆管炎自身抗体的价值与临床应用

王 战， 王 麟， 姚 远， 刘 静， 孙桂荣， 刘明军

青岛大学附属医院 检验科， 山东 青岛 266003

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一种慢性的、胆汁淤积性的自身免疫性肝病[1-2]。患者在疾病早期往往没有明显的临床症状，诊断主要依靠血清胆汁淤积相关指标以及自身抗体的检测，由于出血和感染的风险，肝活检目前并不是PBC的常规诊断方法[3-4]。自身抗体作为一种相对无创的检测方法，具有较高的敏感度和特异度，在PBC的早期诊断中具有重要意义[5-6]。抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody，AMA)是PBC的特征性自身抗体。AMA包括9种亚型，其中AMA-M2亚型是诊断PBC最有意义的自身抗体[7]。除AMA-M2外，约1/3的PBC患者血清中可检测到核膜型或核点型的抗核抗体，如抗核孔膜蛋白抗体(gp210抗体)或抗核体蛋白抗体(sp100抗体)[3,8-9]。2017年欧洲肝病学会指南指出gp210抗体与sp100抗体对诊断AMA阴性的PBC患者具有较好的辅助作用[10]。因gp210抗体与sp100抗体对PBC的诊断特异度较高，可作为一种可靠的血清标志物，减少肝活检的必要性[5]。

目前，我国检测PBC相关自身抗体的主要方法为间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IIF)与免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)。上述两种方法均为定性检测，具有耗时长，操作繁琐的缺点，其结果依赖于操作者的临床经验及技术水平，具有较高的主观性[11]。随着实验室检测技术的不断发展，多重微球流式荧光免疫技术(multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay，MBFFI)，作为一种新型的自身抗体检测技术，以荧光编码微球为核心，能够实现自身抗体的高通量、快速和定量检测[12]，对疾病的诊断与病情评估具有重要意义。本研究将MBFFI定量检测AMA-M2、gp210、sp100 3种自身抗体的结果与IBT进行比较，进一步评估其对PBC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年8月—2020年6月于本院就诊并临床确诊的PBC患者340例(PBC组)，同时选取自身免疫性肝炎(AIH)患者81例与系统性红斑狼疮(SLE)患者62例作为其他疾病组。健康对照组选自于本院的健康体检者117例。PBC诊断依据2017年欧洲肝病学会临床实践指南[4]相关标准：(1)成年胆汁淤积的患者血清ALP水平升高，AMA滴度>1∶40；(2)AMA阴性患者血清中可检测到特异性抗核抗体(核点型或核膜型)；(3)除非患者缺乏PBC特异性自身抗体或合并AIH、非酒精性脂肪性肝病和其他全身性疾病，否则不建议用肝活检进行诊断。AIH诊断标准参照2019 年美国肝病学会实践指引和指南[13]：AIH 的诊断需要符合本病特点的肝组织学检查结果支持，并符合以下特征，(1)血清转氨酶水平升高；(2)血清IgG水平升高和/或一种或多种自身抗体阳性；(3)排除其他可导致慢性肝炎的病因，病毒性、遗传性、代谢性、胆汁淤积性，以及药物可能诱发类似AIH的疾病。SLE诊断依据2012系统性狼疮国际协作组的分类标准[14]，临床标准包括：急性皮肤性红斑狼疮、慢性皮肤性红斑狼疮、口腔溃疡、非瘢痕性脱发、滑膜炎或关节触痛和晨僵、肾脏受累、神经系统受累、溶血性贫血、白细胞或淋巴细胞减少、血小板减少；免疫学标准包括: 抗核抗体阳性，抗dsDNA抗体阳性、抗Sm抗体阳性、抗磷脂抗体阳性、低补体、直接Coombs实验阳性。符合4 项标准(至少符合 1 项临床标准和 1 项免疫学标准)可诊断为SLE。采取受试者空腹静脉血，低速离心后取上层血清，分两份于-36 ℃冰箱冷冻保存，检测前复融至室温。

1.2 研究方法

1.2.1 IBT检测 IBT检测试剂及EUROBlotMaster Ⅱ免疫印迹仪由欧蒙医学诊断公司生产，用于体外定性检测自身免疫性肝病IgG类抗体。本研究中膜条包被的抗原主要包括AMA-M2、gp210、sp100。检测方法：将膜条放入温浴槽中，按照1∶100加入稀释的样本血清，将膜条置于摇床上温浴30 min后洗涤；洗涤结束加入酶结合物温浴30 min，待充分反应后用已稀释的清洗缓冲液清洗膜条3次，5 min/次；最后加入1.5 mL底物液显色，待风干后应用EUROBLineScan 软件判读结果。所有操作均按照操作标准规程进行。

1.2.2 MBFFI检测 MBFFI检测的试剂及Luminex 200TM多功能流式点阵仪由上海透景生命科技有限公司提供。MBFFI检测方法：将待检血清于室温下复融，加载于TESMI F3999全自动加样仪上进行样本处理，应用Luminex 200TM流式点阵仪进行样本检测和数据处理[15]。本研究中3种自身抗体(AMA-M2、gp210、sp100)的cut off值为20 AU。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两种方法对同一种自身抗体检测结果的一致性应用Kappa检验,Kappa≥0.75表明两种方法检测的一致性较好，0.40≤Kappa<0.75 表明两种方法检测一致性一般，Kappa<0.40表明两种方法检测一致性较差。阳性率的比较采用χ2检验。受试者工作特征曲线(ROC曲线)应用Graphpad prism软件进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MBFFI与IBT检验一致性比较 应用MBFFI与IBT对所有样本血清中的AMA-M2、gp210与sp100抗体进行检测，每种抗体的检测阳性率与一致性见表1。两种方法检测的每种抗体的阳性率差异均无统计学意义(P值均>0.05)，一致率均>90.00%。计算两种方法检测的Kappa指数，本研究总体样本中两种方法检测一致性最好的抗体为AMA-M2(Kappa=0.895)。

2.2 MBFFI与IBT对PBC组患者血清自身抗体检测结果比较 应用MBFFI与IBT检测PBC组340例患者血清肝病相关自身抗体，其阳性率与一致性见表2。两种方法进行抗体检测的阳性率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。两种检测方法检测AMA-M2抗体的一致性最好(Kappa=0.874)；两种检测方法检测gp210与sp100抗体的一致性较好(Kappa值分别为0.713、0.749)。

2.3 MBFFI对AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体联合检测的诊断价值 以340例PBC患者为病例组，以其他疾病组与健康体检者为对照组，应用MBFFI联合检测血清AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体，该方法用于诊断PBC的敏感度、特异度等指标见表3。MBFFI对3种自身抗体单项检测时，AMA-M2抗体的敏感度(72.06%)最高。联合检测gp210与sp100两种抗体的敏感度高于该两种抗体的单项检测，联合检测AMA-M2、gp210与sp100 3种抗体的敏感度高于3种抗体的单项检测，而特异度小于单项检测。与单项检测AMA-M2抗体相比，3种抗体联合检测诊断PBC的误诊率略高但漏诊率降低。MBFFI单独及联合检测3种抗体的ROC曲线见图1。3种抗体单项检测时，AMA-M2抗体诊断PBC的ROC曲线下面积(0.850 3)高于gp210抗体(0.703 9)与sp100抗体(0.635 2)。3种抗体联合检测诊断PBC的ROC曲线下面积最大为0.907 0，gp210与sp100抗体联合检测的ROC曲线下面积高于gp210与sp100抗体的单项检测，但低于AMA-M2抗体的单项检测及3种抗体的联合检测。

表1 MBFFI与IBT检测所有样本总体一致性比较

表2 MBFFI与IBT对PBC组患者血清自身抗体检测结果比较

图1 MBFFI检测AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体的ROC曲线

3 讨论

自身抗体的检测对于PBC的早期诊断具有非常重要的意义。AMA是PBC的标志性抗体，而gp210抗体与sp100抗体可出现在30%～50%的AMA阴性的PBC患者中。当患者血清中未检测出AMA，但具有PBC相关生化及临床表现时，可以通过检测gp210与sp100抗体来协助诊断PBC[16]。IIF是检测肝病相关自身抗体最广泛应用的方法，但其缺点在于结果判读易受人为因素影响[17]。随后出现的酶联免疫吸附试验、IBT等检测方法虽然克服了IIF的一些局限性，但仍然具有耗时长、操作繁琐、无法实现自动化等缺点[18]。随着实验室诊断技术的发展，MBFFI将不同颜色的荧光素按照不同比例与聚苯乙烯微球结合，构建100种带有可识别荧光的荧光微球。将100种荧光微球与抗原耦联，可对多种不同抗原抗体结合物进行检测，具有灵活性与多抗体性[17]。

本研究中应用MBFFI对所有血清样本中的AMA-M2、gp210、sp100抗体进行检测，其阳性率与IBT检测相差不大，一致性较好。在340例PBC患者中，MBFFI对AMA-M2、gp210与sp100抗体检测的阳性率与IBT大致相同，一致性较好。IBT为目前检测肝病相关自身抗体较为成熟且应用广泛的检测技术，本研究中MBFFI检测PBC特异性自身抗体与IBT一致性较好，且具有快速、自动化、高通量和定量检测等优势，因此MBFFI有可能成为临床常用的PBC相关自身抗体检测方法。相关研究表明应用MBFFI联合检测多种自身抗体可能提高诊断某些自身免疫性疾病的敏感度[12]，且其检测抗核抗体结果与IBT具有较好的一致性[15]，但尚未发现其他相关研究对MBFFI与IBT检测PBC相关自身抗体结果的对比评价。

表3 MBFFI检测AMA-M2、gp210与sp100抗体的诊断性能

本研究与Villalta等[19]应用INOVA诊断公司的一种基于微球的多重分析系统检测结果相比，应用该方法检测的AMA-M2、gp210与sp100抗体的敏感度分别为63.90%、23.70%、15.50%，均低于本研究所用的MBFFI方法，但其特异度较高，ROC曲线比较显示该研究检测3种自身抗体的ROC曲线下面积为AMA-M2 0.836、gp210 0.528、sp100 0.487。本研究的ROC曲线显示，AMA-M2、gp210与sp100抗体的ROC曲线下面积分别为0.850 3、0.703 9、0.635 2，均高于Villalta等的研究，检测结果的差异可能与地域和种族不同有关。此外，本研究发现AMA-M2、gp210与sp100 3种自身抗体联合检测诊断PBC的ROC曲线下面积更大，提示3种自身抗体联合检测对PBC具有更大的诊断价值，有利于与其他自身免疫性肝病相鉴别。相关研究针对亚洲PBC患者血清gp210与sp100抗体检测敏感度与特异度进行了分析，与亚洲人群检测上述两种抗体的平均敏感度与特异度相比[20]，MBFFI检测gp210抗体的敏感度较低而特异度高，检测sp100抗体的敏感度与特异度与平均水平一致。AMA-M2抗体与其他抗体相比在诊断PBC时具有较高的敏感度与特异度，本研究中当3种抗体联合检测时诊断PBC的敏感度要高于AMA-M2抗体的单项检测，且其漏诊率更低，提示3种抗体联合检测更有利于PBC患者的筛查与早期诊断。

综上所述，MBFFI对于AMA-M2、gp210与sp100 3种自身抗体的检测与IBT相比一致性较好。应用MBFFI联合检测3种自身抗体对诊断PBC的敏感度更高、诊断价值更大，有利于PBC的早期诊断。本研究还需要进行大样本和多中心的研究验证。MBFFI从方法学的角度优于IBT，能够快速、高通量的对样本进行定量检测，易于自动化与标准化，符合临床需求，具有重要的临床价值。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：王战负责标本收集，实验检测，收集资料，数据统计分析，文章撰写；姚远、孙桂荣参与资料整理和分析；王麟、刘静参与收集资料和数据统计；刘明军负责课题设计，拟定写作思路，指导文章撰写。