光裸星虫CyclinB基因克隆及其在卵母细胞中的表达分析

邬 婧 苏泳霖 周丹 钟如卓 郭志诚 王庆恒

摘要：【目的】探究細胞周期蛋白B（CyclinB）基因在光裸星虫（Sipunculus nudus）卵母细胞发育成熟过程中的作用，为揭示光裸星虫卵母细胞发育的分子机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆光裸星虫CyclinB（Sn-CyclinB）基因cDNA序列，通过ProtParam、DNAMAN 9.0、COBALT、SOPMA、Phyer2、Pfam及BLAST等在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测分析Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期的表达情况。【结果】Sn-CyclinB基因cDNA序列全长2468 bp，包括141 bp的5'端非翻码区（5'-UTR）、1097 bp的3'端非翻码区（3'-UTR）及1230 bp的开放阅读框（ORF），编码409个氨基酸残基，在3'-UTR中存在3个胞质多聚腺苷酸化元件（CPE）、1个翻译调控元件（TCE）和1个K-box翻译调控元件。Sn-CyclinB蛋白分子量为46.304 kD，理论等电点（pI）为8.68，具有CyclinB特征序列（FLRRxSK）和Cyclin降解框（RxALGxIxN），属于亲水性蛋白，含有周期蛋白框（Cyclin box）;其二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占56.72%、3.91%、0.73%和38.63%;CyclinB蛋白C端的保守性较N端高;与其他物种相比，光裸星虫Cyclin降解框（RALGTISN）的位置前移了13个氨基酸;光裸星虫与小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白三级结构高度相似。基于CyclinB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树分为无脊椎动物和脊椎动物两大支，其中光裸星虫与小头虫及水蛭等无脊椎动物聚为一支。Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期均有表达，且整体上呈双峰型变化趋势，其相对表达量的峰值分别出现在卵黄旺盛合成后期（O3）和肾管发育时期（O5）。【结论】Sn-CyclinB蛋白具有CyclinB特征序列，其3'-UTR含有多种与翻译调控相关的调控元件，参与光裸星虫卵母细胞减数分裂G1/S期和G2/M期的转换，对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。

关键词： 光裸星虫;细胞周期蛋白B（CyclinB）;Cyclin降解框;表达分析;卵母细胞;减数分裂

中图分类号： S963.219                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1980-11

Cloning of CyclinB gene from Sipunculus nudus and its expression analysis in oocytes

WU Jing1， SU Yong-lin1， ZHOU Dan1， ZHONG Ru-zhuo1， GUO Zhi-cheng1，

WANG Qing-heng1，2*

（1Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong  524025， China; 2Guangdong Provincial Engineering Laboratory for Mariculture Organism Breeding， Zhanjiang， Guangdong  524088， China）

Abstract：【Objective】Exploring the role of CyclinB gene in the development and maturation of Sipunculus nudus oocytes to provide a theoretical basis for further understanding of the molecular mechanism of S.nudus oocyte development.【Method】RACE technology was used to clone the full length of S. nudus CyclinB（Sn-CyclinB） cDNA and the bioinformatics analysis was performed by some online softwares like ProtParam， DNAMAN 9.0，COBALT，SOPMA， Phyer2，Pfam，and BLAST. The real-time fluorescence quantitative PCR technology was used to analyze the expression pattern of Sn-CyclinB in different developmental stages of oocytes. 【Result】The full-length cDNA of Sn-CyclinB was 2468 bp with 141 bp 5'-untranslated region（5'-UTR）， 1097 bp 3'-untranslated region（3'-UTR）， and 1230 bp open reading frame（ORF）. It encoded 409 amino acids and contained three cytoplasmic polyadenylation elements（CPE）， a translation control element（TCE） and a K-box translation regulation element in the 3'-UTR. The theoretical molecular weight and isoelectric point（pI） of Sn-CyclinB protein were 46.304 kD and 8.68 respectively and it had a signature sequence（FLRRxSK） and Cyclin degradation box（RxALGxIxN） which was a hydrophilic protein. Sn-CyclinB protein also contained a cyclin box and the secondary structure of protein， alpha-helix，extension chain，beta-corner， and random curl accounted for 56.72%， 3.91%，0.73%， and 38.63% respectively. It suggested that the C-terminus of CyclinB homologous protein was more conservative than N-terminus. Compared with other species， the position of the Cyclin degradation box （RALGTISN） had moved forward by 13 amino acids and the tertiary structure of Sn-CyclinB protein was highly similar to those of Capitella teleta and Patella vulgata. Phylogenetic tree analysis， based on the similarity of amino acid sequences of CyclinB， showed that CyclinB clustered into invertebrates and vertebrates branches among which S.nudus，C. teleta and Helobdella triserialis were clustered into the invertebrate branch. Sn-CyclinB was expressed in different development stages of oocytes and the trend was bimodal. The higher expression was in the late yolk vigorous synthesis period（O3） and the nephridioduct development period（O5）. 【Conclusion】Sn-CyclinB protein has CyclinB feature sequences and its 3'-UTR has many kinds of regulation elements which relating to translated regulation. Sn-CyclinB protein may be involved in the meiosis transition of G1/S and G2/M phases of the S. nudus oocytes and it will play a crucial role in promoting the orderly progress of oocyte meiosis.

Key words： Sipunculus nudus;CyclinB; Cyclin degradation box; expression pattern; oocytes; meiosis

Foundation item：Guangdong Science and Technology Plan Project（163-2019-XMZC-0009-02-0059，2016A020209 010）; Innovation and Entrepreneurship Training Project for College Students of Guangdong（201810566049）

0 引言

【研究意义】光裸星虫（Sipunculus nudus）俗称沙虫，隶属于星虫动物门（Sipunculida）方格星虫科（Sipunculidae），营穴居生活，以沉积物表面底栖硅藻和有机碎屑为食，生活在温带及热带水域的沿海潮间带，在我国南北海域沿岸均有分布（李凤鲁等，1990;Li et al.，2017），以广东遂溪至广西北海一带最丰富。但近年来由于滩涂环境的改变及破坏性的采捕方式，光裸星虫自然资源量明显下降，使得光裸星虫人工繁育备受关注。关于光裸星虫的工厂化育苗和土池育苗技术已有研究报道（陈振国等，2015），但依靠物理刺激诱导生殖细胞排放的方法并不稳定，其产量远不能满足市场需求。光裸星虫卵母细胞在体腔液中游离发育，期间进行营养物质积累，卵径逐渐增大（王庆恒等，2017），但直接解剖获取体腔液中卵径较大的卵母细胞不具备受精能力，暗示光裸星虫卵母细胞的发育和成熟机制可能较复杂。因此，开展光裸星虫卵母细胞发育机制研究对进一步优化完善其人工繁育技术具有重要意义。【前人研究进展】细胞周期蛋白（Cyclin）广泛存在于真核细胞中，通过激活周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）而参与细胞分裂周期调控（Galderisi et al.，2003;刘丽华等，2016）。其中，细胞周期蛋白B（CyclinB）通过与周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）结合形成具有活性的复合体，即成熟促进因子（M-phase promoting factor，MPF），促进细胞减数分裂G2/M期的转变（翟中和等，2000），随后CyclinB在后期促进复合物（Anaphase-promoting complex，APC）的作用下，通过泛素降解致使MPF失活（Pines，2006）。可见，CyclinB在细胞分裂进程中发挥重要作用。Michael（2016）研究证实，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，缺少CyclinB的早期胚胎存在DNA复制及核膜破裂（Nuclear envelope breakdown，NEBD）延迟现象;Hayashi和Akiyoshi等（2018）研究发现，布鲁士锥虫（Trypanosoma brucei）可通过调节CyclinB降解以控制核分裂时间，CyclinB缺失细胞其纺锤体微管的形成具有一定缺陷。说明CyclinB对纺锤体形成、DNA复制及NEBD等过程起重要作用。至今，有关CyclinB基因在水生动物性腺和生殖细胞发育中的调控作用已有研究报道。蔡明夷等（2014）从大黄鱼（Larimichthys crocea）中克隆出CyclinB基因，并证实其在性腺中的表达量远高于其他组织;刘佳敏等（2019）克隆获得三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）CyclinB基因，通过RNA干扰发现CyclinB基因可调控细胞分裂;Shui等（2019）研究发现，克氏原螯虾（Procambarus clarkii）卵母细胞中CyclinB基因的表达水平随发育进程而呈周期性变化，且这种变化与存在于CyclinB基因3'端非编码区（3'-UTR）的多種翻译调控元件有密切联系。【本研究切入点】本课题组前期构建了光裸星虫不同发育时期卵母细胞的转录组文库（张家炜，2019），发现CyclinB基因在卵母细胞中的表达量较高，且不同发育阶段差异显著，推测其在卵母细胞发育过程中发挥重要作用，但至今尚无针对光裸星虫CyclinB基因序列特征及其生物学功能的研究报道。【拟解决的关键问题】利用RACE克隆光裸星虫CyclinB（Sn-CyclinB）基因cDNA序列，通过在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测分析Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期的表达情况，旨在探究CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞发育成熟过程中的作用，为揭示光裸星虫卵母细胞发育的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试光裸星虫于2018年6月采自广东省湛江市草潭镇潮间带。选取体表完好无损、钻沙能力正常的健康雌虫为研究对象，平均体重12.92±1.68 g。RNA Later购自Sigma-Aldrich公司;TRIzol试剂和SYBR Select Master Mix购自Life Technologies公司;DEPC与6×Loading Buffer购自生工生物工程（上海）股份有限公司;2000 bp DNA Marker、SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒、Premix TaqTM DNA聚合酶、pMD18-T Vector Cloning Kit及大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1. 2 光裸星虫卵母细胞的准备

取30尾雌性光裸星虫，灭菌海水洗净表面砂砾后用注射器抽取体腔液（2 mL/尾），冰浴静置5 min，弃上层悬浮液，收集底部的卵母细胞沉淀，置于5 mL离心管中，加入RNA Later吹打混匀，静置5 min后弃上清液，再加入适量RNA Later吹打混匀，混合所得的全部卵母细胞悬浮液。然后依次使用100、150和300目的细胞筛对卵母细胞悬浮液进行分级分离，获得4种不同粒径的卵母细胞，分别为Oocyte1[<48 μm，卵黄形成初期（O1）]、Oocyte2[48～108 μm，卵黄旺盛合成前期（O2）]、Oocyte3[108～150 μm，卵黄旺盛合成后期（O3）]和Oocyte4[>150 μm，成熟期（O4）]。同时解剖30尾雌性光裸星虫，收集肾管中的卵母细胞（Oocyte5，O5），置于2 mL离心管中并加入RNA Later吹打混匀。另取30尾雌性光裸星虫经阴干刺激后暂养于水族箱中，以100目筛绢网捞取排放到体外的卵母细胞（Oocyte6，O6），加入RNA Later吹打混匀（周丹等，2019）。所有卵母细胞样品经液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1. 3 总RNA提取及cDNA第一链合成

使用TRIzol法分别提取O1～O6的卵母细胞总RNA。以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，并采用SimpliNano超微量核酸蛋白定量仪检测其浓度和纯度。根据SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒说明，合成3'-cDNA和5'-cDNA模板，-20 ℃保存备用。

1. 4 Sn-CyclinB基因cDNA序列克隆

根据本课题组所获转录组数据中Sn-CyclinB基因的部分序列，采用Primer Primer 6.0进行3'-RACE和5'-RACE引物设计（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用巢式PCR对Sn-CyclinB基因的3'-UTR和5'端非翻码区（5'-UTR）进行扩增。反应体系10.0 μL：Premix Taq DNA聚合酶5.0 μL，cDNA模板0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，超纯水3.8 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测巢式PCR扩增产物，将检测结果正确的扩增产物连接至pMD18-T载体上，并转化DH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素的选择培养基筛选合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 5 生物信息学分析

测序结果使用DNAMAN 9.0进行拼接，获得Sn-CyclinB基因cDNA序列;利用NCBI ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测开放阅读框（ORF）及其推导氨基酸序列;运用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测其编码蛋白理化性质;以DNAMAN 9.0和NCBI COBALT（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/）分别进行多序列比对及多重比对分析;使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Phyer2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi？id=index）分别预测编码蛋白的二、三级结构;运用Pfam（https：//pfam.xfam.org/search）进行保守结构域预测;利用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行氨基酸序列同源比对分析，并通过MEGA-X的最大似然法（ML）构建系统发育进化树，可信度检验（Bootstrap）设为1000次。

1. 6 实时荧光定量PCR检测

以不同发育期的光裸星虫卵母细胞cDNA为模板，选择60S-L7基因为内参基因（张家炜，2019），通过Roche LightCycler? 96荧光定量仪检测Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期的表达情况。实时荧光定量PCR反应体系10.0 μL：SYBR Select Master Mix 5.0 μL，cDNA模板0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，超纯水3.8 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环。采用2–ΔΔCt法换算Sn-CyclinB基因相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比较。

2 结果与分析

2. 1 Sn-CyclinB基因测序结果

通过RACE克隆获得Sn-CyclinB基因cDNA序列全长2468 bp（图1），包括141 bp的5'-UTR、1097 bp的3'-UTR和1230 bp的ORF，共编码409个氨基酸残基。Sn-CyclinB蛋白具有2個CyclinB特有的氨基酸序列，分别是第284～290位氨基酸的特征序列（FLRRxSK）和第27～34位氨基酸的Cyclin降解框（RxALGxIxN），且降解框下游区域含有丰富的赖氨酸（Lys）。此外，在Sn-CyclinB基因3'-UTR存在3个胞质多聚腺苷酸化元件（Cytoplasmic polyadenylation element，CPE）（A/UUUUUAU/A）、1个翻译调控元件（Translation control element，TCE）（GUUGU-x23-AUUGUA）及由4个CAAC元件调控的K-box翻译调控元件（核心序列为TGTGAT）。

2. 2 Sn-CyclinB蛋白理化性质及结构域分析结果

Sn-CyclinB蛋白分子量为46.304 kD，理论等电点（pI）为8.68;含有51个负电荷氨基酸残基和55个正电荷氨基酸残基;其脂溶指数（Aliphatic index）为92.05，总平均亲水性指数（GRAVY）为-0.322，属于亲水性蛋白。SOPMA预测结果表明，Sn-CyclinB蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占56.72%、3.91%、0.73%和38.63%。Pfam结构域分析结果（图2）显示，不同物种的CyclinB蛋白均含有1个周期蛋白框（Cyclin box），说明CyclinB蛋白在结构域上具有高保守性。

2. 3 CyclinB同源蛋白多序列比对及Motif分析结果

Sn-CyclinB氨基酸序列与小头虫（Capitella teleta，ELT97248.1）、水蛭（Helobdella triserialis，AAY-46297.1）、白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri，XP_019625405.1）、沙蚕（Platynereis dumerilii，CCI613-76.1）、欧洲帽贝（Patella vulgata，P24862.1）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis，XP_021343652.1）、猫头鹰帽贝（Lottia gigantea，XP_009059647.1）、长牡蛎（Crassostrea gigas，XP_011412035.1）、大西洋冲浪马珂蛤（Spisula solidissima，P13952.1）和台湾鲍鱼（Haliotis diversicolor supertexta，ADP06655.1）的CyclinB氨基酸序列进行比对分析，结果发现CyclinB蛋白在C端的同源性较高，而N端的保守性相对较低。与其他物种相比，光裸星虫Cyclin降解框（RALGTISN）的位置前移了13个氨基酸（图3），且其精氨酸（R）后直接为丙氨酸（A），与公认的Cyclin降解框序列（RxALGxIxN）略有差异。光裸星虫近缘物种小头虫的Cyclin降解框（RGVMGTRNVEQ）与公认的Cyclin降解框序列（RxALGxIxN）也存在明显差异。

对Sn-CyclinB蛋白及其同源蛋白进行Motif分析，结果发现多数物种均具有8个Motifs，但光裸星虫与近缘物种小头虫和水蛭同时缺失Motif6和Motif7。Tomtom预测结果（图4）表明，Motif6为整合素结合位点基序（Integrin binding site，ELME000094），Motif7为Gamma-adaptin ear（GAE）结构域基序（ELME 000107）。缺少的Motif均位于CyclinB蛋白N端，进一步说明CyclinB蛋白在N端的保守性相对较低。

2. 4 Sn-CyclinB蛋白三级结构预测结果

分别对光裸星虫、小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白进行三级结构预测，结果发现光裸星虫、小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白三级结构高度相似（图5），说明CyclinB蛋白三级结构保守。

2. 5 Sn-CyclinB蛋白系统发育进化分析结果

选择欧洲帽贝、虾夷扇贝、长牡蛎、大西洋冲浪马珂蛤、台湾鲍鱼、水蛭、福寿螺（Pomacea canaliculata，XP_025076789.1）、小头虫、真蛸（Octopus vulga-ris，XP_029647095.1）、绿蠵龟（Chelonia mydas，XP_007056452.2）、古茲沙漠地鼠龟（Gopherus evgoodei，XP_030434606.1）、帝王鲑（Oncorhynchus tshawytscha，XP_024274671.1）、龟壳攀鲈（Anabas testudineus，XP_026233375.1）和光裸星虫的CyclinB氨基酸序列构建系统发育进化树，结果（图6）显示，基于CyclinB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树分为无脊椎动物和脊椎动物两大支，其中光裸星虫与小头虫及水蛭等无脊椎动物聚为一支。

2. 6 Sn-CyclinB基因表达模式分析结果

采用实时荧光定量PCR检测分析Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞中的表达模式，结果（图7）表明，Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期均有表达，且整体上呈双峰型变化趋势。光裸星虫卵母细胞在体腔液的发育过程（O1～O4）中，Sn-CyclinB基因的相对表达量先逐渐上升，至卵黄旺盛合成后期（O3）高表达后开始下降;当卵母细胞进入肾管后（O5），Sn-CyclinB基因的相对表达量大幅度上升，与其他发育时各期相比存在显著差异（P<0.05，下同）;卵母细胞排放到体外后（O6），Sn-CyclinB基因的相对表达量急剧下降，显著低于O5，但与O4的差异不显著。

3 讨论

本课题组前期研究发现，Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞中有较高的表达水平，且在不同发育阶段差异显著，故推测Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞的发育过程中发挥重要作用。本研究通过RACE克隆获得Sn-CyclinB基因cDNA序列，并探讨Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞中的功能作用。CyclinB基因的表达在细胞分裂过程中呈周期性变化规律，主要由mRNA翻译水平调控来实现，且多依赖于3'-UTR的翻译调控元件，不同长度的3'-UTR含有不同调控元件，对翻译效率和mRNA稳定性均有一定影响（Shui et al.，2019）。常见的调控元件包括CPE调控元件、TCE调控元件及miRNA结合位点K-box调控元件等。CPE调控元件作为多聚腺苷酸化（Polyadenylation）的顺式作用元件，在卵母细胞成熟过程中介导CyclinB蛋白翻译抑制及翻译激活的过程（de Moor and Richter，1999;Cao et al.，2006）;而TCE调控元件在卵母细胞早期发育过程中对CyclinB蛋白翻译有抑制作用（Dalby and Glover，1993）。此外，具有潜在调控元件（CAAC）的K-box调控元件，可能在CyclinB蛋白翻译过程中发挥负调控作用（Lai et al.，2005）。本研究发现Sn-CyclinB基因与其他物种的CyclinB基因一样，均具有较长的3'-UTR（吴萍，2009;Zhou et al.，2016）。在Sn-CyclinB基因的3'-UTR发现有3个CPE调控元件、1个TCE调控元件和1个K-box翻译调控元件，且这3种调控元件在其他物种CyclinB蛋白中普遍存在（Qiu and Yamano，2005），即Sn-CyclinB基因翻译可能存在复杂的调控过程。

Sn-CyclinB蛋白在第284～290位氨基酸中具有CyclinB蛋白特征序列（FLRRNSK），为环腺苷酸（cAMP）依赖性蛋白激酶A（pKA）催化磷酸化的反应位点（Edelman et al.，1987;Minshull et al.，1989）;第27～34位氨基酸为周期蛋白普遍存在的Cyclin降解框（RALGTISN）。不同物种的Cyclin降解框间存在明显差异，长牡蛎CyclinB蛋白的降解框序列为RAAFGDITN（王桐等，2011），序列中F代替公认降解框氨基酸序列（RxALGxIxN）中的L。与其他物种相比，光裸星虫Cyclin降解框（RALGTISN）的位置前移了13个氨基酸，且精氨酸（R）后直接为丙氨酸（A），与公认的Cyclin降解框氨基酸序列（RxALGxIxN）略有差异。同时发现光裸星虫近缘物种小头虫的Cyclin降解框（RGVMGTRNVEQ）与公认的Cyclin降解框氨基酸序列也存在明显差异，故推测Cyclin降解框中某些氨基酸位点的保守性较低。Sn-CyclinB蛋白的Cyclin降解框后是1个富含Lys的区域，在第44～84位氨基酸中存在7个Lys位点（在Cyclin蛋白中该区域的Lys含量占17%）（Glotzer et al.，1991），可为后期CyclinB蛋白实现泛素降解提供结合位点（Yamano et al.，1998）。

通过多序列比对分析发现，CyclinB蛋白C端的保守性较N端高。Motif分析结果表明，光裸星虫及其近缘物种小头虫和水蛭的CyclinB蛋白均在N端缺少整合素结合位点基序及GAE（Gamma-adaptin ear）结构域基序，进一步说明CyclinB蛋白N端保守性较低。整合素是一种介导细胞与细胞外基质（Extracelluar matrix，ECM）间的跨膜受体，主要参与信号转导、细胞迁移及细胞外基质与细胞间的黏附等过程;整合素还能与生长因子受体协同调节Cyclin-CDKs机制（Schwartz and Assoian，2001）。光裸星虫及其近缘物种小头虫和水蛭同时缺失Motif6和Motif7，推测CyclinB蛋白在进化过程中发生一定程度的分化。基于CyclinB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示，无脊椎动物和脊椎动物分别聚类为两大支，其中光裸星虫与小头虫及水蛭等无脊椎动物聚为一支，暗示CyclinB蛋白在脊椎动物和无脊椎动物间存在一定程度的分化。周期蛋白框可介导细胞周期蛋白与不同CDKs进行特异性结合。保守结构域分析结果显示，不同物种的CyclinB蛋白均含有周期蛋白框。光裸星虫与小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白三级结构高度相似，说明CyclinB蛋白在保守结构域和三級结构域上较保守。

在哺乳动物中发现CyclinB蛋白存在3种亚型：CyclinB1、CyclinB2和CyclinB3。通常情况下，3种亚型CyclinB蛋白表现出分布差异及功能的冗余和互补（Feng and Thompson，2018;Li et al.，2018），在不同细胞发育阶段体现出不一样的作用。Sn-CyclinB蛋白与其他物种的3种CyclinB蛋白进行多重比对，结果发现Sn-CyclinB蛋白与CyclinB2蛋白的一致性较高。已有研究表明，CyclinB2蛋白对细胞分裂周期的早期事件起重要作用，包括参与纺锤体组装的早期过程（Kotani et al.，2001;Yoshitome et al.，2012），促进高尔基体解体（Jackman et al.，1995）和中心体分离与复制（Nam and van Deursen，2014;Spalluto et al.，2013）等，为卵母细胞从G1期进入S期储备物质，而促进细胞周期向S期转变。本课题组前期研究将光裸星虫卵母细胞在体腔液中的发育过程划分为4个阶段，其中，O1～O2主要处于DNA合成前期（G1期），O3～O4处于DNA合成期（S期）至第一次减数分裂（MI）前期（张家炜等，2018）。本研究结果表明，Sn-CyclinB基因的相对表达量从O1到O3呈迅速上升趋势，可能有助于光裸星虫卵母细胞从G1到S期的转变。

在减数分裂G2/M期的转变过程中，作为调节亚基的CyclinB蛋白先与CDK1形成无活性的CyclinB/CDK1复合物，即前体成熟促进因子（pre-MPF）。至G2晚期，在细胞分裂周期蛋白25（Cell division cycle 25，Cdc25）的作用下，CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化及Thr161磷酸化激活MPF，能促进卵母细胞发生生发泡破裂（GVBD）并进入M期（Lew and Kornbluth，1996）。光裸星虫卵母细胞超微结构观察发现，卵母细胞进入肾管后（O5）发生GVBD（张家炜等，2018），而GVBD依赖于MPF的形成。CyclinB蛋白作为MPF的组分之一，CyclinB基因相对表达量在O5大幅上调而有利于GVBD发生，推动减数分裂进程。即Sn-CyclinB基因表达的周期性变化对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。

4 结论

Sn-CyclinB蛋白具有CyclinB特征序列，其3'-UTR含有多种与翻译调控相关的调控元件，参与光裸星虫卵母细胞减数分裂G1/S期和G2/M期的转换，对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）