乙型肝炎病毒血清学检验中应用CLIA和ELISA的作用及检出率分析

程 实 刘利芹

（福建省莆田市荔城区医院，福建 莆田 351144）

乙型肝炎为当下临床高发性病毒性肝炎，病理机制是机体遭受乙型病毒感染，随病情发展可致肝硬化、肝癌等严重并发症形成，危及患者生命安全，需尽早诊断、及时诊疗[1]。实践指出，人体免疫体系遭受乙型肝炎病毒感染后表现出特异性免疫效应，其血清学指标呈较大改变，因而对乙型肝炎病毒血清学指标展开测定有助于早期评定乙型肝炎，同时做好预后评估。CLIA（化学发光免疫分析法）、ELISA（酶联免疫吸附法）均为检测方法，其中ELISA检测过程简单、迅速，且成本较低，但亦具局限性，难以做到精确定量分析[2]。CLIA不但具有较高的检测敏感度，且能够迅速完成定量分析，因而在临床得到广泛运用，尤其是在乙型肝炎病毒相关性血清标志物测定中效果显著。本研究取2018年1月至2020年1月86例疑似病例展开研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年1月于本院就诊的疑似乙型肝炎病毒患者研究，统计86例。视实时荧光定量PCR检测所得结果为金标准，分别采用CLIA、ELISA就血清学标志物（表面抗原、e抗原、e抗体及核心抗原、表面抗体）展开测定。纳入病例男50例，女36例，年龄最大值、最小值分别为75岁、24岁，平均年龄为（49.51±7.26）岁。纳入标准：经患者同意，并签订知情书；无沟通障碍；伴恶心呕吐、全身乏力及肝区疼痛等表现。排除标准：肝肾肺器质性病变；凝血功能障碍；罹患精神疾病；检查禁忌证。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂的选择 选择ELISA400全自动螺旋发光酶免一体机，仪器自身含有酶标仪；由安图生物工程提供CLIA试剂盒，由北京万泰生物药业有限公司提供ELISA试剂盒。

1.2.2 检测方法 将实时荧光定量PCR所检验结果视作乙型肝炎诊断金标准，具体方法：选取100 μL血清标本及试剂盒对照品，实施离心处理（1 000 r/min），时间10 min，取其上清液，然后置于血清标本100 μL震荡摇匀后，再次实施离心操作，时间为10 min，转速1 000 r/min，弃上清液，在沉淀物中置于血清标本（25 μL），震荡混匀，沸水浴10 min后离心，取上清液。取PCR反应液37.6 μL，将其放置于离心管中，而后添入Taq酶与尿苷酶（0.06 μL），视作反应管，添加处理标本与对照品各2 mL，设定对照品浓度梯度，混匀后送至待检区，采取核酸扩增仪完成PCR扩增。

CLIA：基于机体空腹状态下抽取其5 mL外周静脉血，离心10 min，分离血清备检。备检血清标本需置于聚苯乙烯试管，采取50 μL辣根过氧化酶予以标记，而后置于37 ℃环境下，1 h后采取磷酸盐缓冲液实施冲洗，3min/次，冲洗6次。完成以上步骤后，在室温下添加氢氧化钠（0.1 mol/L，100 μL），静置10 min，然后添加过氧化氢（50 μL，3%），测定发光强度，如若e抗原临界数值超过1.00，视作阳性。

ELISA：将浓缩洗涤液使用蒸馏水亦或是去离子水20倍稀释；按顺序进行样品对应微孔板的编号，不同板应设置阴性对照3孔，阳性对照2孔及空白对照孔，对于双波长测定，不设空白对照孔；除空白孔外，各孔均置入20 μL样品稀释液，分别于对应孔中放置待测样品亦或是阴阳性对照100 μL，缓慢振荡混匀；以封板膜将微孔板实施封闭，置于（37±1）℃环境下温育，时间1 h左右。而后再在每孔中添加酶标识剂（50 μL），轻轻振荡混匀，再次封板置于（37±1）℃环境下温育，时间半小时左右。揭掉开封板膜，采取洗板机洗涤，至少5遍，最后1遍尽可能扣干，最后加入显色剂A、B液，均为50 μL，振荡混匀，基于（37±1）℃避光环境下显色半小时，加入终止液（50 μL），10 min内测定结果。

1.3 观察指标 ①实时荧光定量PCR测定结果。②CLIA、ELISA测定结果。③统计CLIA、ELISA检测于血清学标志物中的测定结果，如表面抗原、e抗原、e抗体及核心抗原、表面抗体。

1.4 统计学方法 借助SPSS22.0软件对研究数据展开处理分析，计量资料用（）表示，以t检验。计数资料用率表示，以χ2检验，P＜0.05存在统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR测定结果 经检测发现，86疑似病例中，乙型肝炎达到52例，检出率60.47%，其中表面抗原、e抗原、e抗体及核心抗原、表面抗体阳性检出例数分别为8例、10例、15例、9例、10例，34例为乙型肝炎病毒感染，但其DNA为阴性。

2.2 CLIA与ELISA测定结果 结果显示，CLIA真阳性、真阴性比为49∶29；ELISA真阳性、真阴性比为40∶32。见表1。

表1 CLIA与ELISA测定结果比较（n）

2.3 CLIA与ELISA诊断效能 相比于ELISA检测，CLIA阴性预测值、敏感度及准确度明显较高，对比P＜0.05；两组阳性预测值及特异度比较P＞0.05。见表2。

表2 CLIA与ELISA诊断效能比较（%）

2.4 CLIA、ELISA检测于血清学标志物中的测定结果 结果显示，CLIA于血清学标志物中检出率[94.23%（49/52）]相比于ELISA[69.23%（36/52）]明显更高（χ2=10.883，P=0.001）。

3 讨 论

乙型肝炎为高发性病毒性肝炎，患病率较高，且极易反复发作。研究表示，乙型肝炎患病早期症状无典型性特征，导致漏诊、误诊风险增加，进而使疾病恶化，危及患者生命安全，因而找寻有效、安全的早期诊断方法尤为重要[3]。乙型肝炎病毒血清标志物测定为当下临床鉴别、诊断乙型肝炎的重要方法，传统标志物测定多由ELISA完成，该检测方法具简单、快速及价格低廉等优势，在乙肝疾病诊断、诊疗中具一定作用，同时此方法于定性分析中具较好的效果，但在定量分析检测中效果欠佳，因标本测定物浓度偶有浓度升高表现，导致钩状效应形成，对测定结果精准性产生影响。ELISA测定原理为借助酶显色原理完成测定，测定精密度相对较低，当抗原亦或是抗体与酶联结合物浓度处于较低水平时，其吸光度较低，极易出现假阴性的问题，所以，ELISA测定方法全面性不足，推广受限。随医学事业发展及进步，ELISA已无法满足现阶段对乙型肝炎病毒标志物的检测及诊断，基于此背景下，CLIA相应而生[4]。CLIA工作原理在于利用发光底物具备的发光强度特征对标志物实施测定，具较高的敏感度，可进行体内血清标志物实际状况的直观了解，备受临床青睐[5]。

本次研究取2018年1月至2020年1月疑似病例实施研究，结果发现，相比于ELISA，CLIA检测精准性、阴性预测值及敏感度明显提高，组间对比P＜0.05，两组特异度、阳性预测值比较P＞0.05；CLIA于血清学标志物检出率较ELISA高，组间对比P＜0.05，提示CLIA较ELISA有着更高的检出率，可精准检出低浓度表面抗原，直观反映出HBV受染进程，为后期临床制定诊疗方案奠定坚实基础[6]。不仅如此，CLIA于诊疗效果评价方面、测定HBV复制方面均具重大意义，考虑是CLIA在测定过程中借助科学性能较高全自动仪器及相应的试剂对血清标志物展开测定，从一定程度上避免了外在因素的感染，确保其测定稳定性。ELISA易遭受手工加样等因素影响，使标志物颜色深浅发生变化，从而影响结果精准性。因测定方法局限性，使表面抗原测定物易呈现出假阴性状态。有学者发现，CLIA利用顺磁性微粒固相载体，其反应面积较大，能够反复多次利用标志物，将发光时间延长，从而增强反光强度，进而对HBV受染进程清晰反映，保证CLIA测定稳定性[7-9]。焦阳[10]研究中，CLIA于表面抗原、e抗原、e抗体等标志物中检出率较ELISA高，提示CLIA可动态化测定乙型肝炎病情的进展状况，与本次研究中，CLIA于血清标志物检出率94.23%（49/52）高于ELISA69.23%（36/52）近似一致，证实本研究真实可行。但限于纳入样本数量较少，关于CLIA检测的远期效果还需进一步论证。

综上所述，乙型肝炎病毒血清学检验中采取CLIA（化学发光法）具较高的检出率，可辅助临床制订诊疗方案，并为预后评估提供有力依据，属理想、可行性较高的诊断方法，值得推广及进一步运用。