安徽合肥地区2018—2019年犬细小病毒遗传进化分析

姬凯元， 邱月阳， 程 敖， 蒋书东， 彭梦玲

(安徽农业大学 安徽省畜禽遗传资源保护与生物育种重点实验室，安徽 合肥 230036)

犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒亚科(Parvovirinae)，原细小病毒属(Protoparvovirus)[1]，可引起犬急性出血性肠炎和幼犬心肌炎。虽然CPV是DNA病毒，但其显示出与RNA病毒相似的高突变率，VP2基因每年每个位点的替换量约为10-4[2]。自1978年在美国首次报道原始CPV-2亚型以来，在世界范围内相继发现CPV-2a[3]、CPV-2b[4]、CPV-2c[5]、New-CPV-2a[6]、New-CPV-2b[7]、CPV-2c(a)[6]和CPV-2c(b)[6]等8种亚型。

CPV是一种没有包膜结构的单股线状DNA病毒，基因组全长5.3 kb，包括两个主要开放阅读框(open reading frame，ORF)[1]。ORF1编码非结构蛋白(NS1 和 NS2)，其中，NS1是一种多效性核磷蛋白，主要诱导机体细胞凋亡，对于病毒在机体内的复制至关重要[8]；ORF2主要编码衣壳蛋白(VP1和VP2)，VP2作为主要的结构蛋白，决定CPV的组织嗜性和宿主范围[9]；两侧为非编码区(untranslated region，UTR)。流行病学调查发现，目前国内流行株主要以New-CPV-2a、New-CPV-2b和CPV-2c为主[10-12]。为了解近年安徽地区CPV的遗传变异情况，本研究通过采集2018—2019年安徽地区动物医院疑似犬细小病毒感染犬粪便或肛门拭子，提取的DNA进行鉴定并随机选取10株进行全基因组序列分析，了解安徽地区犬细小病毒主要亚型和遗传变异情况，期望为CPV的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料的收集

采集2018—2019年安徽部分地区(合肥市区、长丰县、马鞍山市)动物医院具有犬细小病毒感染症状的疑似病例粪便53份(合肥市区28份，命名为AHhf 1-28；长丰县7份，命名为AHcf 1-7；马鞍山市18份，命名为AHmas 1-18)。

1.2 主要试剂

pMD TM 19-T载体、DL2000 DNA Marker、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PrimeSTAR MAX聚合酶、EsTaq聚合酶、质粒小提试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank中CPV-SH1516株(MG013488)基因序列，采用Primer Premier 5设计CPV鉴定引物(CPV-F/R)和3对特异性引物(C1-F/R-C3-F/R)用于扩增中间片段；参照Han等[11]和Yu等[13]的方法设计特异性引物Y1、Y2，U1、U2分别用于扩增CPV 3′端的Y型发夹结构和5′端的U型发夹结构。引物由通用生物系统有限公司合成(表1)。

表1 鉴定与全基因组序列扩增引物

1.4 CPV基因组DNA提取与鉴定

DNA提取试剂提取样品DNA，具体步骤按说明书进行。以提取的DNA作为模板进行PCR检测，反应体系：2×TaqPlus MasterMix(Dye)DNA聚合酶5 μL、CPV-F/R各0.5 μL、DNA模板1 μL，ddH2O补足至10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、35个循环；72 ℃ 10 min。1.0%琼脂糖电泳检测PCR产物，南京擎科生物科技有限公司测序。

1.5 CPV分型鉴定

为鉴定安徽地区31组阳性病料感染CPV所属亚型，PCR法扩增CPV的VP2基因序列，根据测序结果鉴定合肥地区流行毒株的所属亚型。

1.6 CPV全基因组扩增与结构分析

根据PCR鉴定结果，随机选择10株CPV阳性样品，采用表1引物分7段扩增CPV全基因组。使用DNAStar软件对扩增的7段CPV基因片段进行拼接，获得完整的CPV序列，分析CPV的基因结构。

1.7 CPV遗传进化分析

使用MEGA 6.0软件分析安徽10株CPV与NCBI中28株CPV参考株(表2)的遗传进化特点，绘制遗传进化树。根据序列特点分析NS1基因和VP2基因在遗传进化分支中是否同步，初步探究CPV在进化的过程中是否涉及基因重组现象。

表2 CPV-2参考毒株

2 结果与分析

2.1 CPV的PCR鉴定结果

PCR鉴定结果显示，53份待检样品中，有31份样品扩增出约1 031 bp大小的单一条带(随机选8株结果进行展示，如图1所示)，测序检测确定为CPV阳性样品。

2.2 CPV分型鉴定

31份阳性样品CPV-VP2氨基酸序列分析发现，4株VP2第297位氨基酸为Ala，且426位为Asn，属于New CPV-2a，占总体12.90%；1株第297位氨基酸为Ala，且426位为Asp，属于New CPV-2b，所占比例为3.23%；27株第297位氨基酸为Ala，且426位为Glu，属于CPV-2c，占绝对优势，比例为83.87%(表3)。综上可见，安徽地区以CPV-2c为主要流行毒株。

表3 CPV安徽分离株关键氨基酸位点信息

2.3 CPV全基因组测序结果

以AHhf1扩增结果为例，7对特异性引物均可扩增出单一的核酸片段，且大小与预期一致(图2)。测序分析发现，7段扩增产物均为CPV片段。

2.4 CPV基因组结构分析

使用DNAStar软件拼接10株CPV测序数据，获得10株完整的CPV序列。分析发现，安徽地区分离的10株CPV的基因组序列长度在5 055～5 061 bp，长度存在一定差异。ORF1和ORF2分别编码主要的非结构蛋白(NS1、NS2)和结构蛋白(VP1、VP2)，10株CPV的编码区长度相同；3′UTR长度相同，均为269 bp，Y型回文结构长度均为120 bp；5′UTR长度为516～522 bp不等，U型回文结构长度为193～199 bp(表4)，由此可见，10株CPV基因序列长度差异主要是5′UTR核苷酸的突变、插入和缺失造成。

表4 10株CPV安徽株基因组结构分析

2.5 遗传进化分析

基因组遗传进化分析发现，38株CPV分为两个进化分支，其中，亚洲地区流行的24株(22株中国株、1株越南株和1株泰国株)形成一个单系群，而国外株(包括欧洲、美洲和大洋洲共14株)形成另一个单系群(图3)。在中国株的单系群中，又可分为两个进化分支，安徽地区分离的10株CPV和其他14株CPV均起源于CPV-2aB004(EF011664)和CPV-LZ1(JQ268283)两株，合肥地区流行的CPV主要以CPV-2c亚型为主，正在形成一个独立的分支。NS1和VP2基因遗传进化树显示，同一进化分支中，NS1和VP2基因遗传进化树之间不完全相同(图4、图5)。对于病毒而言，表面抗原(VP)和内部抗原(NS)所经历的选择压力不同，为逃避宿主的免疫监视，CPV的表面抗原突变的频率会显著高于内部抗原[14]，因此VP2的变异比NS1发生得更快。同时，NS1和VP2基因在遗传进化分支中的不同步现象，也为CPV的重组提供了依据。

2.6 VP2抗原突变特征

氨基酸差异分析发现，安徽地区分离的6株CPV-2c毒株(AHhf1、AHcf4、AHhf1、ANhf7、AHhf27、AHhf28)的VP2蛋白与表2中CPV-2c参考毒株同源性高，没有发生特异性的突变；安徽地区分离的3株NEW-CPV-2a(AHmas2、AHmas16、AHmas17)与表2中11株NEW-CPV-2a参考毒株相比，AHmas2的VP2蛋白存在4个新的氨基酸突变位点(第5位氨基酸由Asn突变为Gly，第13位氨基酸由Pro突变为Ser，第370位氨基酸由Gln突变为Arg，第426位氨基酸由Asn突变为Glu)；安徽地区分离的1株NEW-CPV-2b与表2中4株NEW-CPV-2b参考毒株相比，存在部分氨基酸位点的突变，具体位点见表5。这种新的突变表示合肥毒株在形成地方特色的同时，也在不断地进化。但是这种突变是否引起VP2蛋白结构和功能的变化，还需要进一步研究。

3 讨论

CPV 呈世界性分布，在中国和其他亚洲国家(包括韩国、泰国、日本、印度、蒙古[15]、越南[16]、老挝[17]等)以CPV-2a毒株为主要毒株，而许多欧洲、北美、拉丁美洲和非洲国家以CPV-2c毒株为主要流行毒株[18-20]。流行病学调查发现，2009—2015年，在中国北京[21]、河南[22]、甘肃[11]、黑龙江[6]、四川[23]和南京[24]等省份流行的CPV毒株以New CPV-2a为主，且有少量New CPV-2b。2016年至今，我国以CPV-2c毒株感染发病的比例在逐渐增加，CPV-2c和New CPV-2a在中国部分区域成为优势毒株[25]。本研究对31株安徽地区分离的CPV分型发现，2018—2019年安徽地区流行的CPV主要以CPV-2c型(27/31株)为主。遗传进化分析发现，安徽地区分离的CPV正在形成了远离国外CPV-2分离株的单簇，这表明安徽地区流行的CPV主要毒株可能来源于原始CPV-2分离株，从而在中国地区进一步适应与进化，而不是直接自国外引入。

VP2蛋白作为构成CPV衣壳的主要成分，暴露于衣壳表面，决定病毒感染的宿主范围、凝集血红细胞等功能，是刺激机体产生中和抗体的主要抗原[9]。CP的防控主要以荷兰英特威(Intervet)、美国辉瑞(Pfizer)、法国梅里亚(Merial)和美国富道(Fort Dog)等公司生产的CPV弱毒疫苗为主。调查发现，富道公司的CPV弱毒苗以CPV-2b毒株为疫苗株制备，其余公司的CPV弱毒苗都是以CPV-2为疫苗株制备。虽然有研究表明，疫苗株为CPV-2和CPV-2b的CPV疫苗对CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c突变体具有保护作用[26]，但是由于VP2抗原的高突变频率，可能导致CPV毒株的中和抗原表位发生变化，导致已接种CPV疫苗株的犬群感染CPV[27]。分析安徽地区10株CPV的VP2氨基酸序列特点发现，表2中11株NEW-CPV-2a参考毒株相比，安徽地区分离的部分NEW-CPV-2a毒株存在4个新的氨基酸突变位点(第5位氨基酸由Asn突变为Gly，第13位氨基酸由Pro突变为Ser，第370位氨基酸由Gln突变为Arg，第426位氨基酸由Asn突变为Glu)；安徽地区分离的1株NEW-CPV-2b与表2中4株NEW-CPV-2b参考毒株相比，存在部分氨基酸位点的突变(表5)。但是这种突变是否引起VP2蛋白结构和功能的变化，还需要进一步研究。

表5 VP2蛋白氨基酸突变位点统计表

由于成年犬和已免疫犬发生犬细小病毒感染的数量日趋增加，因此，加强本地区CPV的流行病学研究和遗传进化分析具有重要意义。结合本研究和以往年份中国地区CPV亚型流行情况分析，CPV-2c已然成为安徽地区CPV-2的优势毒株，同时CPV-New2a与CPV-New2b共同参与循环。期望本研究可以为CPV的研究提供参考。