基于生物素化纳米抗体检测拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸的研究

张译丰，郭城钎，柳 彬，沈玉栋，王 弘，陈子键，罗 林，徐振林*

（1. 广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学 食品学院，广东 广州 510640；2. 中国生物兰州生物制品研究有限责任公司，甘肃 兰州 730046；3. 福建省东山海关综合技术服务中心，福建 漳州 363400）

拟除虫菊酯类农药是模拟天然拟除虫菊酯合成的，含有苯氧烷基的环丙烷酯类化合物［1］。此类农药具有神经毒性、生殖毒性、免疫系统毒性与肿瘤毒性等［2－5］，对人畜健康有一定危害。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是拟除虫菊酯类农药最主要的代谢产物，也是其重要的风险暴露评估指标。除虫菊酯类农药可通过环境接触和食物链进入机体内，在人体中能被迅速吸收并代谢成极性更高的3-PBA，主要存在于血液和尿液中［6］。研究发现，成人尿液样本中检测到3-PBA的占比高达91.3%，中位数水平范围为0.30～18.3 ng/mL［7－9］。调查显示，男性不育症患者尿液中的3-PBA 浓度与精子质量呈负相关［10］，同时研究表明3-PBA 具有抗雌激素的特性，会使生物体内分泌代谢紊乱［11］。目前3-PBA 作为尿液分析物已被美国、加拿大等国家纳入卫生监测的研究对象［12］。3-PBA 的半衰期比菊酯类农药更长（180 d），生物毒性更大，在土壤中的迁移速率也较快，人们有可能通过环境接触3-PBA。因此开展3-PBA 的检测方法研究，对实现对3-PBA及拟除虫菊酯类农药的监控和风险暴露评估具有重要意义。

仪器检测法是检测3-PBA的常用方法，主要包括高效液相色谱法（HPLC）［13－14］、液相色谱－质谱联用技术（LC－MS）［15－16］和气相色谱－质谱联用技术（GC－MS）［17-18］。色谱法虽结果准确，但因操作较复杂、成本较高，难以用于大量样品的筛查。免疫分析法是基于抗原－抗体特异性识别原理的分析技术，具有特异性强、检出限低、检测成本低、操作简便、便携等特点，适用于大批量样品的现场快速筛选。针对食品、环境中3-PBA 的免疫分析方法主要有酶联免疫吸附分析法（ELISA）和竞争性免疫层析技术。Chuang 等［19］建立了尿样中代谢物3-PBA 的ELISA 检测方法，并与GC－MS 法进行比较，相关系数达到0.95，检出限为0.1 ng/mL，回收率为92%～100%。Wang 等［20］制备了抗拟除虫菊酯类单克隆抗体，并建立了icELISA 法用于水样中多种拟除虫菊酯类代谢物的检测，该方法的IC50为0.8 ng/mL，回收率为74%～108%。Kim 等［21］利用纳米抗体建立icELISA 方法用于人尿中3-PBA 的检测，IC50为1.4 ng/ mL，LOD 为0.1 ng/mL，同时通过使用携带噬菌体的纳米抗体进一步建立Phage－icELISA 方法，回收率为80%～112%，检出限低至0.01 ng/mL，比LC－MS/MS法的灵敏度更高。Liu等［22］获得了抗3-PBA 的单克隆抗体，并制备出相应的试纸条用于河水中3-PBA的检测，检出限为1 μg/mL，反应时间仅10 min。

有关纳米抗体的报道多为蛋白质等大分子，且纳米抗体存在体内半衰期短等缺点［23］。针对小分子的骆驼源纳米抗体在实际应用中灵敏度较低的情况，Kim等［21］首次用3-PBA半抗原偶联甲状腺球蛋白免疫羊驼，制备得到特异性较好的阳性克隆并用于icELISA法检测人尿中的3-PBA。本研究在Kim等［21］获得的3-PBA纳米抗体的基础上，建立了生物素化纳米抗体的icELISA方法，从而为3-PBA的快速灵敏检测提供了思路。

1 实验部分

1.1 实验材料

3-PBA 质粒为加州大学戴维斯分校Bruce Hammock 教授馈赠；3-PBA（98%，Alfa Aesar 公司）；聚丙烯酰胺溶液（30%，Bio－Rad 公司）；甘油（≥99%，Biosharp 公司）；多聚辣根过氧化物（HRP）酶标记的链霉亲和素（2～4 μg/mL，polyHRP－SA，Thermo 公司）；HRP 酶标记His 标签多克隆抗体（1 mg/mL，上海艾博抗贸易有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（分析纯，英国OXOID 公司）；考马斯亮蓝R－250（≥85%）、吐温－20（96%）购自广州速研生物公司；咪唑（≥99%）、卵清蛋白（OVA，98%）、牛血清蛋白（BSA，98.6%）购自美国Sigma 公司；酶标板、96 孔白色发光板（深圳金灿华实业有限公司）；N，N，N，N-四甲基乙烯二胺（98%）、十二烷基磺酸钠（95%）、过硫酸铵（≥98%）、甘氨酸（≥99%）购自广州健阳生物科技有限公司；葡萄糖（≥99.8%，上海博奥公司）；四环素（95%）、氨苄青霉素（≥85%）、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG≥99%）购自上海源叶生物科技有限公司；生物素－NHS（85%，天津希恩思生化科技有限公司）。

1.2 3-PBA纳米抗体的表达纯化

挑取携带pComb3x－3-PBA 纳米抗体表达载体的TOP 10F’大肠杆菌单菌落，接种到10 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）和盐酸四环素（100 μg/mL）的LB 培养基（LB－Amp－TC）中摇菌（下文摇菌条件均为37 ℃，250 r/min）过夜。将过夜菌扩大培养到1 L 的LB－Amp－TC 中，摇菌至OD600nm值达到0.6～0.8时，加入IPTG 溶液（1 mmol/L）诱导表达12 h。菌液离心，弃去上清，加入5 mL TES 溶液（12.1 g Tris，0.093 g EDTA，85.575 g 蔗糖，500 mL 水，盐酸调至pH 8.0），搅拌至沉淀完全分散，～80 ℃冻结，37 ℃解冻，反复冻融3次。最后一次解冻后加入12 mL纯水和3 mL TES溶液，放入摇床10 ℃，180 r/min摇30 min，离心取上清液。上清液加入咪唑－磷酸盐缓冲溶液（PBS）使咪唑终浓度为10 mmol/L，再加入1 mL Ni－NAT 填料充分混匀后转移到层析柱中，使未与填料结合的非特异成分流穿。分别用10、20 mmol/L咪唑－PBS洗去未结合的非特异性成分，再用浓度为50、100、200 mmol/L的咪唑－PBS分别洗脱纳米抗体并收集洗脱液。取适量流穿液及不同浓度咪唑洗脱液进行SDS－PAGE检测。用0.01 mol/L PBS透析纳米抗体洗脱液将咪唑除去，超滤管将蛋白溶液浓缩至1 mg/mL以上，-80°C保存。

1.3 3-PBA纳米抗体生物素化

称取5 mg 生物素－NHS 溶于200 μL DMSO，逐滴加入到5 mg 溶于pH 8.0 PBS 缓冲液的纳米抗体（生物素与纳米抗体的摩尔比为50∶1）中，4 ℃反应过夜，次日用PBS 透析未反应的生物素－NHS。透析结束后，进行icELISA验证生物素化后抗体活性。其余分装放置－80 ℃冰箱备用。

1.4 基于生物素化纳米抗体的icELISA程序

将包被原用碳酸缓冲液稀释至所需浓度，以100 μL/孔加入酶标板中，37 ℃水浴箱静置过夜。次日洗涤2 次（每次用300 μL 含吐温-20 体积分数为0.005%的PBS（PBST）），然后在吸水纸上拍干酶标板。加入120 μL/孔蛋白封闭液，37 ℃静置3 h，然后倒掉孔中液体，在吸水纸上拍干，37 ℃烘干后使用或4 ℃密封保存备用。

用PBS将3-PBA纳米抗体和3-PBA标准药物稀释至所需浓度，酶标板中每孔加入50 μL抗体稀释液以及50 μL 3-PBA标准溶液，37 ℃孵育40 min，洗板5次，拍干。用PBST将polyHRP-SA 稀释至合适浓度，每孔加100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，拍干。TMB 显色液A 液和B 液等体积混匀后，每孔加100 μL，37 ℃反应10 min，然后每孔加入50 μL终止液（10%H2SO4），用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光值（A450nm）。

1.5 icELISA条件的优化

采用棋盘滴定法，分别对包被原和抗体进行稀释（包被原质量浓度为500、250、125、62.5 ng/mL；抗体稀释倍数为1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，体积比），用icELISA 法测定3-PBA 质量浓度为0的条件下各抗原抗体浓度组合的A450nm，选择A450nm在1～1.5之间的抗原抗体稀释组合，用icELISA 检测不同3-PBA 浓度下的A450nm，用Logistics 函数拟合标准曲线，得出各个不同抗原抗体浓度组合下的IC50和最大吸光值Amax。

配制不同pH 值（5.4、6.4、7.4、8.4、9.4），不同PO3-4浓度（10、20、40、60、80 mmol/L），不同吐温（Tween－20）体积分数（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的PBS用于稀释纳米抗体和3-PBA标准药物。在优化的缓冲液条件下，将polyHRP－SA稀释不同倍数（1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000，体积比），用icELISA 法检测不同浓度3-PBA 下的A450nm，用Logistics 函数拟合标准曲线，得出各不同抗原抗体浓度组合下的IC50和最大吸光值Amax。

综合考虑Amax/IC50值较大且曲线拟合度较好的条件为优化条件。

1.6 样品前处理

将环境水样品（湖水、水库水、自来水、饮用水）以8 000 r/min离心20 min，0.22 μm水系滤膜过滤后直接用于测定。

2 mL人尿液样品用0.22 μm滤膜过滤后加400 μL 6 mol/L HCl，100 ℃水解1 h；加入4 mL pH 4.5的0.2 mol/L醋酸钠缓冲液进行中和，再加入6 mol/L NaOH调至pH 4.0左右。用C8固相萃取（SPE）柱纯化水解后的尿液样品，具体操作如下：空柱依次加入2 mL 甲醇、2 mL ddH2O 以及2 mL 醋酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH 4.0）活化SPE柱；向SPE柱中加入2 mL水解后的尿样；向SPE柱中依次加入3 mL ddH2O、3 mL甲醇洗涤杂质，真空干燥10 min；用正己烷－乙酸乙酯（7∶3）加1%醋酸配成洗脱液，用3 mL洗脱液洗脱SEP柱上的3-PBA。洗脱液氮吹至近干后，用2 mL含10%甲醇的PBS复溶，－20°C保存。

2 结果与讨论

2.1 3-PBA纳米抗体制备及生物素化后活性表征

3-PBA 纳米抗体经Ni-NAT 纯化后的SDS－PAGE 结果如图1 所示，控制上样体积一致时，200 mmol/L 咪唑洗脱液的条带明显深于50 mmol/L和100 mmol/L时，说明用200 mmol/L 咪唑洗脱纳米抗体的效果最佳；同时，由于抗3-PBA 纳米抗体的等电点在8.1 附近，为避免纳米抗体在纯化过程中沉淀，需将洗脱液pH值调至远离等电点。因此选择pH 7.4的200 mmol/L咪唑溶液为洗脱液。

图1 经Ni－NAT纯化后3-PBA纳米抗体的SDS－PAGEFig.1 SDS－PAGE image of 3-PBA nanobody purified by Ni－NAT

生物素化后的纳米抗体用polyHRP-SA作为酶标物进行icELISA 检测，当包被质量浓度为125 ng/mL，纳米抗体的工作质量浓度为500 ng/mL 时，在1 μg/mL 3-PBA 标准溶液中的抑制率为92.2%，说明3-PBA 纳米抗体生物素化成功。

2.2 icELISA反应条件的优化及优化条件下的标准曲线

本研究所建立的方法示意图如图2A 所示。抗原包被浓度、缓冲液离子浓度、pH 值、吐温浓度、二抗稀释倍数等条件是icELISA 方法的稳定性与灵敏度的重要影响因素，因此需优化上述因素以确定最佳的icELISA实验条件。

2.2.1 icELISA 抗原、抗体浓度组合的优化 选定的包被原和抗体浓度范围内，当包被原浓度越高，A450nm达到1.0～1.5时所需的抗体稀释倍数越小，反之亦然。一方面，减少包被原浓度有利于3-PBA 与包被原竞争抗体结合位点；另一方面，减少抗体浓度有利于抗体与相对低浓度的3-PBA充分结合，从而提高检测灵敏度。但由于A450nm达到1.0～1.5之间的抗原、抗体浓度呈此消彼长的关系，因此必须进一步通过3-PBA抑制曲线来选择最优条件。选择包被原质量浓度（ng/mL）－抗体稀释倍数为500－1∶4 000，250－1∶3 000，125－1∶2 000，62.5－1∶500的条件测定3-PBA的抑制曲线。

如图2B 所示，在包被原质量浓度从500 ng/mL 降低到125 ng/mL 的过程中，IC50值呈现减小趋势，说明灵敏度增强；而当包被原质量浓度降低到62.5 ng/mL后，IC50值突然激增。从Amax/IC50值亦能看出，当包被原质量浓度为125 ng/mL，抗体稀释2 000倍时，其比值最大。

图2 基于生物素化纳米抗体icELISA方法的示意图及实验条件的优化Fig.2 Illustration of the biotinylated nanobody based icELISA for 3-PBA and the optimization for experimental conditions

2.2.2 缓冲液pH 值的优化 抗体为具有活性的蛋白因子，pH 值过高或过低均会对其活性造成影响，也会影响抗体和药物的溶解度。本文选定pH 值分别为5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的PBS 作为反应体系测定3-PBA抑制曲线，结果如图2C所示。在pH 6.4左右，Amax/IC50值达到最大。

2.2.3 缓冲液离子浓度优化 离子浓度对icELISA 反应有重要影响，本实验分别选定10、20、40、60 mmol/L 等一系列磷酸盐浓度的PBS 作为反应体系测定3-PBA 的抑制曲线。如图2D 所示，随着离子浓度的上升，Amax值呈下降趋势，IC50值先降后升，当离子浓度为40 mmol/L 时，Amax/IC50值最高，说明此时icELISA反应的灵敏度最大。

2.2.4 吐温浓度的优化 为研究吐温－20含量对icELISA 法灵敏度的影响，本实验在PBS中添加不同体积分数（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的吐温－20。结果显示，当吐温－20 的体积分数为0.005%时Amax/IC50值最高。因此，选择在PBS中添加0.005%吐温－20。

2.2.5 polyHRP－SA 稀释倍数的优化 在确定3-PBA 纳米抗体的最佳稀释倍数和包被浓度后，polyHRP－SA 和前者反应的量也需优化。用上述确定的最优缓冲液条件将polyHRP－SA 分别按照1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000和1∶7 000倍（体积比）稀释后进行icELISA 检测。结果显示，当稀释倍数为1∶4 000时，Amax/IC50值最高。因此，选择polyHRP－SA的最佳稀释倍数为1∶4 000。

按照上述优化条件，得到本实验的最佳icELISA 反应条件：3-PBA－BSA 包被质量浓度为125 ng/mL，3-PBA 纳米抗体稀释倍数为1∶2 000，反应缓冲液体系为pH 6.4，离子浓度为40 mmol/L，吐温－20体积分数为0.005%的PBST溶液，二抗稀释倍数为1∶4 000。

2.3 线性范围及检出限

在最佳实验条件下，用质量浓度分别为200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.012 8 ng/mL的3-PBA系列标准溶液建立icELISA 标准曲线，经拟合得到该标准曲线的IC50为1.7 ng/mL，线性范围为0.37～7.4 ng/mL（见图3）。检出限定义为抑制率10%对应的待测物浓度（IC10），经计算，得到LOD（即IC10）为0.15 ng/mL。

图3 优化条件下3-PBA的标准曲线Fig.3 Standard curve of 3-PBA under the optimized conditions

2.4 样品基质效应的消除

2.4.1 人尿样品 采集4 个来源于不同人的尿液（阴性），过0.22 μm 滤膜后用pH 6.4 的40 mmol/L PBST 进行1、2、4、8 倍稀释后，分别用于稀释3-PBA 标准药物，同时用PBST稀释3-PBA 标准药物作为对照组，分别进行icELISA 测定并绘制标准曲线。结果显示，人尿液样品通过0.22 μm 滤膜过滤后，需稀释20 倍才能消除基质干扰，方法的灵敏度降低。图4A为滤膜过滤后，不同稀释倍数对其中一尿液样品基质效应的影响。

为了优化前处理方法，尿样先经过高温酸水解，然后用SPE 柱进行纯化和富集，再进行稀释。由图4B 可知，经过酸水解和SPE 纯化的尿样仅需稀释8 倍后的标准曲线与PBST 标准曲线基本重合，即稀释8 倍可消除基质效应。与直接过膜稀释相比，酸水解和SPE 纯化的前处理方法能显著提高实际样品的检测灵敏度。

图4 不同样品前处理方法对人尿样品基质效应的影响Fig.4 Influence of different sample pretreatment methods on matrix effect of a human urine sample

2.4.2 水样品 取4 种不同环境水样（湖水、水库水、自来水、饮用水）经离心、过滤膜处理后，用pH 6.4的40 mmol/L PBST 进行1、2、4倍稀释后，分别用于稀释3-PBA 标准药物，同时用PBST 稀释3-PBA 标准药物作为对照组，分别进行icELISA 测定并绘制标准曲线。结果显示，环境水样品稀释不同倍数后，其标准曲线与PBST标准曲线高度重合，说明环境水样品基质效应较小，不会对样品检测造成干扰。因此，环境水样品经离心、过膜处理后，无需稀释即可直接用于icELISA检测。

2.5 加标回收率与相对标准偏差

采集人尿、湖水、水库水、自来水和饮用水共8种阴性空白样品，在本方法的线性范围内选择低、中、高3 个加标水平，按优化方法进行加标回收实验，每种样品测定3 次，取平均值。测得人尿样品的加标回收率为87.6%～97.8%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～10%；环境水样品的加标回收率为78.0%～127%，RSD为0.83%～9.3%（见表1）。

表1 icELISA对实际样品中3-PBA的回收率及相对标准偏差Table 1 Recoveries and RSDs of 3-PBA in actual samples by icELISA

3 结 论

本研究在前期获得的抗3-PBA 纳米抗体的基础上，以pComb3X－3-PBA 表达载体制备3-PBA 纳米抗体并进行生物素化。所得生物素化纳米抗体以多聚HRP 标记的链霉亲和素为酶标物建立了3-PBA 的icELISA 分析方法，优化了包被源浓度、抗体浓度、反应缓冲体系中离子浓度、pH 值、多聚HRP标记链霉亲和素稀释倍数等参数。最优条件下，3-PBA的检出限为0.15 ng/mL，IC50为1.7 ng/mL，线性范围为0.37～7.4 ng/mL。8 种实际样品的加标回收率为78.0%～127%，RSD 均不大于10%。该方法的准确性高、操作简便，可作为拟除虫菊酯类农药使用的暴露评价。