时间分辨荧光侧流分析法检测水中17β-雌二醇

王凌凌，王文龙，杨 成，徐正华，张 毅*，史学丽

（1. 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学 食品学院 分析食品安全学研究所，江苏 无锡 214122；3. 中华人民共和国黄埔海关，广东 广州 510730；4. 石家庄市妇幼保健院，河北 石家庄 050051）

17β-雌二醇（E2）是所有内分泌干扰物中具有最强活性的天然雌激素，常被用作更年期女性的内分泌调节药物［1］。然而，当E2通过饮用水和食物在人体内积累超过安全阈值时，会损害人类健康、破坏机体平衡，甚至危害后代［2］。2002年我国农业部176号公告中明确禁止在饲料和动物饮用水中使用E2［3］，食品法典委员会（CAC）和中国国家食品安全标准也规定不得在动物食品中检出E2。E2的检测方法主要有色谱法［4］、电化学法［5］、表面增强拉曼光谱（SERS）法［6］等。其中，色谱法灵敏度高、稳定性好，但无法应用于现场检测；电化学法和SERS法响应快速、灵敏，均可用于现场检测，但稳定性和重现性较低。

侧流分析（LFA）是一种纸基快速检测技术，成本低、操作简单、可实现现场检测，目前已广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。侧流分析技术在E2的检测应用已有报道，Wang等［7］曾以胶体金为标记物、构建了E2等3种雌激素的LFA 试纸，并成功应用于牛奶加标样的检测。胶体金因其显色结果肉眼可见而常用作LFA 显色探针，但其灵敏度较低且读数结果具有主观性。为提高试纸灵敏度，可采用金纳米花［8］、金纳米棒［9］或对胶体金二次标记［10］，或以小分子有机染料［11］、量子点［12］、上转换纳米粒子［13］等为信号探针开发荧光型LFA，但上述荧光型LFA 存在试纸荧光背景干扰或需要高能量激光光源等弊端。

本文基于免疫识别和荧光共振能量转移（FRET）原理，以偶联E2 包被原（E2－BSA）的长余辉粒子（PLPs）为荧光供体，以胶体金标记抗体（CG－mAb）为荧光受体，建立了E2 的竞争型时间分辨荧光（TRF）LFA。本方法以低功率紫外灯为激发光源，以智能手机连拍功能实现TRF 模式采集试纸的检测区荧光图像，有效去除试纸荧光背景干扰进而提高信噪比；以余辉优良的大尺寸PLPs为荧光信号源并利用其在硝酸纤维素膜上不迁移的特性将E2竞争物固定于检测区，巧妙解决了常规试纸对信号材料尺寸的纳米级别限制和小尺寸PLPs余辉短暂的矛盾。本方法可应用于水样中E2的快速、灵敏检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JEM－2100HR 透射电镜、SU8010 扫描电镜（日本日立株式会社）；F－7000 荧光分光光度计（日本日立有限公司）；X 射线衍射仪（i国布鲁克有限公司）；Nano-ZES Zeta 电位分析仪（英国马尔文仪器公司）；Nicolet Nexus470傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR，美国热电公司）；UV-3600 PLUS紫外可见近红外光谱仪（日本岛津公司）；ZF-8紫外灯箱（灯管功率6 W，上海嘉鹏科技有限公司）；e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），250 mm×4.6 mm，5 μm C18X Bridge柱，2475 FLR检测器。

流动相：乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。LFA 试纸材料（上海杰一生物技术有限公司）：硝酸纤维素膜（NC 膜，Sartorius CN95），样品垫（GL－b06玻璃纤维素膜），吸收垫（H5072纤维素垫），底板（型号DB-7）。长余辉材料（PLPs，杭州质诚科技开发有限公司）。吐温-20（化学纯）、蔗糖、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA，生物试剂）、17β-雌二醇（E2，国药集团化学试剂有限公司）。双酚A（BPA）、己烯雌酚（DES）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）、柠檬酸三钠二水化合物（上海阿拉丁生物技术有限公司）。小鼠抗E2单克隆抗体（mAb）、羊抗鼠二抗（上海羽朵生物科技有限公司）。所用试剂除特别注明外均为分析纯。实验用水为超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

湖水样品取于江苏省无锡市江南大学小蠡湖；自来水样品取自实验室自来水龙头；饮用水样品为桶装洞庭山饮用天然泉水，购于苏州碧螺天然泉食品饮料有限公司。

1.2 纳米材料的制备

参考Dou 等［14］采用柠檬酸钠还原法制备胶体金（CG），通过吸附作用与mAb 偶联制备CG－mAb，离心（30 min，4 ℃，10 000 r/min）后的产物以0.2 mL 重悬缓冲液（20 mmol/L 硼酸盐缓冲液含5%蔗糖，1%BSA，pH 8.2）溶解储存备用。

参考Wang、Yang 等［7，15］方法合成E2 羧甲基醚（E2－CME）和E2－BSA 偶联物（E2－BSA）。参考Paterson等［16］对商品化的PLPs进行二氧化硅封装，参考Chen等［17］修饰羧基。然后，以活性酯法将E2－BSA 与修饰了羧基的PLPs 进行偶联制备E2－BSA－PLPs 复合物［18］，产物以2 mg/mL（以长余辉浓度计算）在PBS溶液中储存备用。

1.3 TRF－LFA试纸的构建

在组装并切割好的试纸检测区（T 区）和质控区（C 区）分别滴加1.0 μL 2 mg/mL E2－BSA－PLPs 和0.5 μL 0.1 mg/mL羊抗鼠二抗，烘箱中37 ℃干燥30 min，于真空袋中4 ℃保存备用。

1.4 液相色谱条件

流动相：乙腈（A），2%乙酸－水（B），洗脱梯度：0～7 min，50%A；7～7.5 min，50%～100%A；7.5～10.5 min，100%A；10.5～11 min，100%～50%A；11～12 min，50%A。进样量：10 μL，流速：1.0 mL/min，柱温：25°C；激发波长：280 nm，发射波长：310 nm。

1.5 实际样品分析

对水样进行检测并做加标回收实验，加标质量浓度分别为0、0.10、1.0、10 ng/mL。水样不需前处理，直接将80 μL水样与20 μL CG－mAb和10 μL运行缓冲液（10 mmol/L磷酸盐缓冲液含10%蔗糖，8%BSA，0.25%吐温－20，pH 7.4）在离心管中混合5 min后，将试纸条插入离心管，25 min后读取结果。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

TRF－LFA 试纸原理如图1所示。C 区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显红色。样品溶液和CG－mAb 预混合后在毛细作用下向吸水纸方向移动，当样品无E2 时，CG－mAb 被T 区E2－BSAPLPs捕获，肉眼可见T区显红色，而E2－BSA－PLPs和CG－mAb之间发生FRET使PLPs荧光猝灭，多余的CG－mAb 被C 区的二抗捕获从而C 区也显红色；当样品中含有E2 时，其与部分CG－mAb 结合减少了T 区捕获的CG－mAb 总量，肉眼可见T 区显浅红色甚至无色，而E2－BSA－PLPs 和CG－mAb 间的FRET减少甚至消失，使PLPs的荧光恢复。随着样品中E2浓度的增大，被捕获于T区的CG－mAb越来越少，T区逐渐变淡，而长余辉的亮度逐渐增大。当PLPs开始发出微弱的荧光信号时，所对应的E2最低浓度为荧光法的检出限。为采集PLPs荧光信号，将显色完成试纸条置于6 W 254 nm紫外灯下激发后，以智能手机作为荧光图像采集设备，以连拍模式获取紫外光源关闭前后的荧光图像，从中筛取信噪比最高者用于分析。

图1 时间分辨荧光侧流层析示意图Fig.1 Schematic illustration for TRF－LFA

2.2 CG－mAb和E2－BSA－PLPs的表征

2.2.1 CG－mAb的表征 采用透射电镜对CG的形貌及制备质量进行表征，可见所制备的CG平均粒径在15 nm 左右，大小均匀，分散性好（图2A）。进一步采用紫外－可见吸收光谱和电位法对偶联前后的CG 进行表征，可观察到CG 在520 nm 处有最大吸收峰（图2B），Zeta 电位为－26.0 mV（图2C）；与mAb 偶联后，CG－mAb 在278 nm（mAb）和525 nm（CG）处有吸收峰（图2B），Zeta 电位从－26.0 mV 变至－18.1 mV（图2C）。以上结果表明所制备的CG质量较好，表面成功修饰了E2－mAb，可以用于侧流层析试纸。

图2 CG的透射电镜图像（A），CG与CG－mAb的紫外－可见吸收光谱（B），CG、CG－mAb、PLPs和E2－BSA－PLPs的Zeta电位（C），E2－BSA与E2－BSA－PLPs的红外光谱（D）Fig.2 TEM image of CG（A），UV－Vis absorbance spectra of CG and CG－mAb（B），Zeta potentials of CG，CG－mAb，PLPs and E2－BSA－PLPs（C），FT－IR spectra of E2－BSA and E2－BSA－PLPs（D）

2.2.2 E2－BSA－PLPs的表征 作为时间分辨荧光信号源的PLPs为商品化固相合成产物，采用扫描电镜图像对PLPs的形貌进行表征，可见其粒径为微米级别，在NC膜上不迁移，符合预期；进一步采用X射线能量色散谱（EDS）对PLPs的元素组成进行测量，得到PLPs的化学组成为SrAl2O4基质，掺杂有1%（质量比）的Eu元素。供货方声称掺杂有Dy元素，但可能由于掺杂量极少，EDS未检出。PLPs的基质SrAl2O4是SrO－Al2O3体系中一种较稳定的化合物，其晶体结构中的大量缺陷可实现光子的吸收，而掺杂的Eu2+作为发光中心。通过红外光谱法和电位法对E2－BSA修饰前后的PLPs进行表征，可观察到E2－BSA－PLPs的FT－IR吸收光谱与E2－BSA基本一致（图2D），修饰后PLPs的表面电位由3.1 mV变为－20.0 mV（图2C）。

采用荧光光谱及紫外－可见吸收光谱分别对供体PLPs及荧光受体CG－mAb进行扫描。结果显示，PLPs的最大荧光发射峰在520 nm，而CG－mAb的最大吸收峰也刚好在520 nm 左右（图3A），满足荧光共振能量转移（FRET）要求荧光供体分子的发射光谱与受体分子的吸收光谱相重叠的要求。

紫外光照下，试纸和PLPs 均会发出荧光（图3B 插图①）；在关闭紫外灯后，试纸上的荧光立刻消失，而PLPs仍能发射荧光（图3B插图②）。荧光衰减曲线显示在光源关闭后2 min左右时，PLPs的发光降低至初始强度的10%，20 min后降至1%（图3B），表明该大尺寸PLPs具有优良的余辉性能。

图3 PLPs的荧光发射光谱及CG－mAb的吸收光谱（A），PLPs的荧光衰减曲线（B）Fig.3 Fluorescence emission spectrum of PLPs and absorbance spectrum of CG－mAb（A），fluorescence decay curve of PLPs（B）

2.3 LFA条件的优化

2.3.1 CG－mAb 制备条件的优化 本文所设计FRET 型LFA 要求CG－mAb 能有效猝灭PLPs的荧光，因此需要CG－mAb 稳定且吸收强度高。以此为优化依据，考察了制备CG－mAb 时K2CO3（用于调节pH值）和mAb的用量。利用吸附作用制备CG－mAb时，体系pH值接近于抗体的等电点时能在CG表面实现最有效的吸附。因此，以添加K2CO3调节体系pH 值，发现K2CO3的浓度为0.4 mmol/L 时，CG 在520 nm波长下的吸光度值最大（图4A），所以后续实验选择0.4 mmol/L K2CO3为最佳添加量。

胶体金表面抗体修饰量对于免疫识别起关键作用：修饰抗体过少，对抗原的识别难以实现；修饰抗体过多，不利于竞争型试纸消线（即T 区不捕获CG－mAb）。在优化的K2CO3浓度下，当每毫升胶体金中抗体添加量小于5 μg 时，金标抗体出现不同程度的聚集，当抗体添加量大于5 μg/mL 时，金标抗体溶液保持红色，状态稳定（图4B）。因此，选择mAb 的最低用量为5 μg/mL。考虑到实验过程中的损失，在最低用量的基础上额外增加20%作为实际抗体量，即每毫升胶体金储备溶液中添加6 μg mAb进行标记。

2.3.2 FRET 型试纸荧光供体和受体用量的优化 FRET 型试纸荧光供体E2－BSA－PLPs 和受体CG－mAb 的用量也是影响体系灵敏度的重要因素，因此，分别考察了显色模式和TRF 模式下阴性样品的信号强度以优化二者的用量。图像用Image J 的灰度模式分析。显色模式下可见随着CG－mAb用量和T 区E2－BSA－PLPs 浓度的增加，T 区的显色深度逐渐增加（图4C）。当T 区的E2－BSAPLPs 质量浓度为1 mg/mL 时，T 区显色过浅，不利于分析，E2－BSA－PLPs 在另两个高质量浓度下，CG－mAb 的3 种用量结果差别不大。TRF 模式下，当T 区的E2－BSA－PLPs 质量浓度为1 mg/mL 时，阴性样品和不同剂量CG－mAb 的混合物流过T 区后虽能完全猝灭其荧光，但由于其初始荧光亮度较低，阳性样品的检出较困难。当T 区E2－BSA－PLPs 浓度为4 mg/mL 时，虽然其初始荧光非常明亮，但阴性样品和CG－mAb 混合物流过后很难完全猝灭其荧光，即使CG－mAb 的用量高达20 μL 也无法将荧光全部猝灭。因此T 区的E2－BSA－PLPs 质量浓度设定为2 mg/mL，此浓度下荧光亮度适中且20 μL CG－mAb 的猝灭效果最好（图4D）。

2.3.3 激发时间及荧光照片采集时间的优化 激发时间和荧光照片采集时间也是TRF 型试纸的重要参数。因此，分析了阴性（0 ng/mL）和阳性（10 ng/mL）样品在不同激发时间（5、10、20、40、60 s）和采集时间（0.1、0.5、1.0、1.5 s）下的信号强度，以寻找对分析物E2 最灵敏的时间参数。结果显示，随着激发时间的增加，阴性和阳性样品试纸T 区的荧光均逐渐增强，20 s 达到光饱和，然而不同激发时间下阳性和阴性样品的荧光差值变化不大，因此，为使阴性样品具有尽可能低的荧光，后续实验选取5 s作为激发时间（图4E）。从荧光关闭前后连拍图像分析发现，荧光关闭后阴性和阳性样品T区的荧光亮度都逐渐降低。为了满足阳性和阴性样品的荧光差值较大且阴性样品亮度较低的要求，选取0.5 s 作为荧光照片的捕获时间（图4F）。

图4 制备CG－mAb时K2CO3浓度（A）和mAb浓度（B）对产物吸光度的影响；显色模式（C）和TRF模式（D）下CG－mAb用量和试纸T区E2－BSA－PLPs用量对信号的影响；TRF模式下激发时间（E）和荧光照片捕获时间（F）对信号的影响Fig.4 Effects of K2CO3（A）and mAb（B）concentrations on the absorbance of CG－mAb；Effects of E2－BSA－PLPs and CGmAb dosages on the signal intensity of visual mode（C）and TRF mode（D），respectively；Effects of excitation time（E）and fluorescence photo capture time（F）on the signal intensity of TRF mode

2.4 LFA分析性能

2.4.1 方法的检出限 以所构建试纸检测不同质量浓度E2 标准溶液并分析试纸T 区显色和TRF 信号强度。显色模式下，阴性和低浓度阳性试纸T区呈现明显紫红色，E2质量浓度增加至5 ng/mL时T区颜色变淡，10 ng/mL 时T 区颜色消失（图5A），以此质量浓度为显色法检出限；TRF 模式下，阴性T 区无明显荧光，E2 质量浓度为0.1 ng/mL 时T 区发出微弱的光（图5B），以此质量浓度为TRF 法检出限。因此，所构建的TRF型试纸的检出限（0.1 ng/mL）较显色法检出限（10 ng/mL）约低2个数量级。

图5 显色（A）及TRF（B）模式下试纸对不同质量浓度E2的响应Fig.5 Response of the strip at different E2 concentrations under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.4.2 方法的选择性 进一步考察了所构建试纸在显色和TRF模式下对E2的几种结构类似物的响应以验证试纸特异性。10 ng/mL E2可使T区褪色（图6A）、显示荧光（图6B），而10倍质量浓度的E1、BPA和DES的信号与阴性无显著差别（图6），表明与E2无交叉反应。5倍质量浓度的E3不干扰E2的检测，但10倍质量浓度的E3会同时引起两种模式下信号的改变（图6B），这可能是由于E3较其他雌激素与E2的结构更为相似。

图6 显色（A）及TRF（B）模式下试纸对几种雌激素类物质的响应Fig.6 Responses of strips to several estrogens under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.5 实际样品的检测

为确定本方法的有效性，以HPLC－FLD法对比分析水样及其加标样品（表1）。HPLC－FLD法可检出10 ng/mL 加标E2，回收率为87.3%～96.4%，相对标准差（RSD）小于6.3%。CG－LFA 可检出10 ng/mL加标E2。TRF－LFA法可检出0.1 ng/mL及以上加标E2（图7），且约30 min内即可完成分析。

图7 显色（A）及TRF（B）模式下试纸对加标水样的响应Fig.7 Responses of strips to spiked water samples under the visual image（A）and TRF image（B）modes

表1 实际样品中3种方法对E2的检测结果（n=3）Table 1 Analytical results of E2 in real samples by three methods（n=3）

3 结 论

本文基于FRET 原理构建了E2 的TRF－LFA 方法，以余辉优良、微米尺寸的PLPs 为T 区固定荧光探针，低功率紫外灯激发结合智能手机拍摄实现TRF 模式荧光采集，有效去除试纸荧光背景干扰进而提高信噪比。该方法具有比胶体金显色法低两个数量级的检出限和较好的特异性，且可在30 min 内完成检测，适用于现场筛查。