不同丛枝菌根真菌菌剂对滇重楼及土壤中营养元素的影响

赵顺鑫，魏祖晨，李卓蔚，许凌峰，郭冬琴，周 浓，杜慧慧

重庆三峡学院生物与食品工程学院 三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120

作为植物生长直接基质的根际土壤为植物的生长发育提供保障，土壤中的微生物组成及酶活力影响着土壤微生态系统，对土壤理化性质、养分循环和植物生长等具有重要的影响[1]。土壤微生物群落在调控土壤物质循环和改善土壤质量起到关键性作用[2]。丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌可以改善土壤的营养成分，促进植物养分吸收利用，提高药用植物的产量和品质[3,4]，同时对污染土壤、盐碱土壤的生态恢复发挥积极作用[5]。

野生滇重楼资源的枯竭，使得人工栽培和引种栽培成为滇重楼研究的主流[6]。但因其地理位置，种植年限的差异，导致滇重楼的品质不一[7]。据报道，接种不同AM真菌能够提高滇重楼薯蓣皂苷元的含量、改善土壤的理化性质、提高土壤养分和优化微生物结构[7,8]，促进滇重楼幼苗期叶片叶绿素合成，提高幼苗光合能力[9]。Zhang等[10]报道滇重楼种子共生萌发时接种薄壁两性囊霉(Ambisporaleptoticha)和崔氏原囊霉(Archaeosporatrappei)可提高滇重楼幼苗的成活率和产量。另外，接种不同AM真菌可以促进滇重楼根际对土壤营养元素的吸收利用、提高滇重楼品质[11]。Yang等[12]发现接种优选的混合AM真菌菌剂增加滇重楼根中内源激素含量比接种单株真菌的效果更好。前期研究[13]发现不同AM真菌混剂能够提高根际土壤中球囊霉素含量和酶活性，改变微生物群落结构，从而改善土壤环境，也能促进滇重楼对外界不利环境的抗逆性，提高滇重楼总皂苷含量，诱导滇重楼次生代谢的变化，增加有效成分，从而提升滇重楼的药用品质。

通过接种AM真菌改善土壤环境和提升药材品质已成为一种趋势。土壤中营养元素含量水平受栽培土壤营养水平和植株自身习性的影响[14]。Shen等[15]发现，接种不同AM真菌后滇重楼根茎和根际土壤中的钙、镁、钠等含量均高于未处理组，且促进根茎对元素的吸收来提高品质。Gu等[16]研究表明，不同AM真菌混合接种可增加木香对营养物质的吸收，促进代谢产物的积累，提高木香内脂的产量和入药品质。而接种不同AM真菌混剂后对滇重楼和土壤微生态中营养元素影响的研究较少。基于此，本研究通过接种不同组合的AM真菌菌剂后，测定滇重楼不同部位以及土壤中的营养元素的含量，旨在解析不同AM真菌菌剂对滇重楼和土壤中营养元素的影响，以期能够最大化利用土壤的营养元素，减少资源浪费，同时为滇重楼生物菌肥的研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养

样品于2013年10月采自云南省大理白族自治州农业科学推广研究院种植基地(25°35′27.69′′N，100°18′23.17′′E，海拔1 980 m，年均气温14.9 ℃，年降雨量1 051.1 mm)，经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科重楼属滇重楼P.polyphyllavar.yunnanensis。选择大小一致且无虫害的滇重楼新鲜根茎为研究对象。12种AM真菌菌剂均购自美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心(INVAM)，由重庆三峡学院微生物实验室进行扩增繁殖、储存保管。菌剂扩繁的基质使用山基土和河沙按3∶1体积比混合制成[11]。

栽培基质为菜园土与河沙按体积3∶1混合，于高压灭菌锅内121 ℃灭菌2 h，置于口径15 cm，高18 cm的无菌塑料容器中。采用室温盆栽的方法，于重庆市万州区铁峰山国家森林公园内试验种植基地(30°56′12.05′′N，108°22′32.89′′E，海拔1 230 m)进行种植。分别设置丛枝菌根真菌处理组S1～S9和对照组CK，每盆3株苗，每组10个重复。不同处理组每盆接种含4或6种丛枝菌根真菌共120枚孢子的混合菌剂(均分)，并定期浇灌Hoagland营养液，具体信息详见表1。

表1 不同处理组及其接种丛枝菌根真菌Table 1 Different treatment groups and inoculation of AM fungi

1.2 样品采集与处理

分别在4个时期(T1：2015年6月；T2：2015年7月；T3：2015年8月；T4：2015年9月)将滇重楼植株小心取出，不伤害其根系，获得叶、茎、根茎和须根。采用He等[17]方法将靠近顶芽第一茎痕处并带有顶芽的切段为新根茎，余下的部分为老根茎，置于45 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过80目筛，用于滇重楼元素含量测定分析。同时采集土壤样品，实验室自然风干至恒重，粉碎过80目筛，用于土壤相关元素含量测定分析。

1.3 仪器与试剂

TAS-990AFG型原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；C-MAG HP10型数显加热板(德国IKA集团)；DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)空心阴极灯(北京曙光明电子光源仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。所用水为去离子水，试剂均为优级纯。

1.4 测定方法

采用凯氏定氮法[18]测定滇重楼与土壤中的氮元素含量，采用钒钼黄比色法[19]测定滇重楼中的磷元素含量，采用硫酸-高氯酸消煮法[18]测定土壤中磷元素含量，采用原子吸收光谱法[20]测定滇重楼与土壤中钾、钙、镁元素含量。

1.5 数据处理

采用Excel 2016软件进行数据处理，使用SPSS 25分析软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同采收时期滇重楼中氮、磷、钾、钙、镁元素吸收和分布规律

滇重楼不同采收期其根、茎、叶中氮、磷、钾、钙、镁含量分布规律如表2所示。就对照组而言，4个时期滇重楼不同部位氮含量整体表现为先升高后下降的趋势，在T3时期新、老根茎氮的含量达到最大；T1时期，S3、S4、S5、S6和S7处理组滇重楼叶中氮的含量均增加，S7新根茎氮的含量增加，S6处理组滇重楼新根茎、老根茎和叶中氮的含量增加；S8处理组T1时期新、老根茎和叶，T2时期新根茎和叶以及T4时期新、老根茎中氮的含量增加。综上，S8处理组氮含量的增加效果比较好。磷在滇重楼新根茎和叶中含量较高，其中T4时期S6处理组滇重楼的新、老根茎中磷含量最高。S8处理组T1时期新根茎中磷的含量增加，达6.289 g/kg。钾元素可以影响植物品质及根茎次生代谢产物合成积累。对钾的含量分析发现，钾含量表现为茎>叶>根茎。T4时期S8处理组的老根茎中钾含量较高，为12.715 g/kg。

表2 接种丛枝菌根真菌对滇重楼5种元素吸收的影响Table 2 Contents of five elements in P.polyphylla var.yunnanensis inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

续表2(Continued Tab.2)

不同时期处理组滇重楼钙含量大部分高于对照组，表明接种丛枝菌根真菌能有效提高滇重楼抗逆性，保证滇重楼正常生长。采收期对照组的滇重楼的钙含量表现为茎>叶，老根茎>新根茎。而处理组的钙含量新根茎>老根茎，表明不同处理组可促进新根茎对钙元素的蓄积。其中S4、S6和S8处理组T1时期叶的钙含量增加，S6处理组T1时期新根茎的钙含量、T3时期茎和叶的钙含量增加，S8处理组T1和T3时期茎和叶以及T4时期新、老根茎的钙含量增加，推测S8处理组可以促进滇重楼对钙的吸收，增加植物的抗逆性。对镁含量进行测定分析发现，相较于对照组，不同处理组滇重楼镁的含量不同程度发生改变。其中，T1、T4时期S6组的老根茎中镁含量较高，T3时期新根茎含量较高。S8处理组在T1、T2和T4时期新根茎的镁的含量较高，最高可达28.142 g/kg。因此，不同AM真菌混合后可不同程度上促进氮、磷、钾、钙、镁的吸收及在根茎中的蓄积。

2.2 不同采收时期土壤中营养元素含量分析

通过凯氏定氮法、硫酸-高氯酸消煮法和原子吸收光谱法测定接种不同AM真菌菌剂后土壤中的氮、磷、钾、钙、镁5种元素的含量。由表3可知，不同处理组土壤中的氮、磷、钾、钙、镁5种元素的含量与对照组存在显著差异。在T1、T3和T4时期，S8处理组的土壤中钙的含量明显比对照组高，且T1时期滇重楼不同部位的钙含量，T3时期滇重楼茎和叶中，T4时期滇重楼新根茎中钙的含量都明显升高。表明土壤中的钙含量的升高有利于植物各个部位钙的蓄积及转移。S6处理组在T2和T4时期钙的含量最高，均大于141.000 g/kg。不同处理组土壤中的氮、磷、钾和镁元素的变化量不大，而S6、S8处理组滇重楼的新根茎、老根茎和叶中氮的含量显著升高，S7处理组的新根茎和叶的氮含量也明显增多，最高可达4.799 g/kg，T1时期S8和S1处理组滇重楼的新根茎的磷含量比其他处理组高，最高可达到6.289 g/kg，推测不同AM真菌可以促进滇重楼对氮元素的吸收和蓄积。

表3 接种丛枝菌根真菌不同时间土壤中五种元素含量Table 3 Contents of five elements in soils inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

2.3 滇重楼与土壤元素相关性分析

为了分析滇重楼不同部位与栽培土壤中营养元素的关系，通过相关性分析发现，滇重楼老根茎与土壤中的营养元素有不同程度的相关性。老根茎中的氮与老根茎中钙和镁存在极显著正相关(r=0.516、0.680，P<0.01)，老根茎中的钙与镁的含量呈显著正相关(r=0.337，P<0.05)，老根茎中的钙与土壤中的钙呈显著负相关(r=-0.315，P<0.05)，与土壤中的镁存在极显著负相关(r=-0.469，P<0.01)，土壤中的钙与土壤中的钾存在显著负相关(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的镁和钙存在极显著正相关(r=0.455，P<0.01)，结果见表4。滇重楼新根茎与土壤中5种元素的相关性为：新根茎中的氮和磷呈极显著正相关(r=0.407，P<0.01)，新根茎中的镁和新根茎中的磷与钾呈极显著正相关(r=0.500、0.421，P<0.01)，土壤中的钙和钾呈显著负相关(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的钙和镁呈极显著正相关(r=0.455，P<0.01)(见表5)。表6展示了滇重楼叶与土壤中5种元素存在一定的相关性：叶中的氮和钙呈显著正相关(r=0.407，P<0.05)，叶中的钾与镁呈极显著正相关(r=0.587，P<0.01)，土壤中的钙与叶中的磷呈显著正相关(r=0.365，P<0.05)，与叶中的钾呈显著负相关(r=-0.362，P<0.05)，土壤中的钙与土壤中的钾呈显著负相关(r=-0.438，P<0.05)，与土壤中的镁呈显著正相关(r=0.46，P<0.05)。

表4 不同丛枝菌根真菌处理滇重楼老根茎元素与土壤元素相关性分析Table 4 The correlation analysis of the old tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表5 不同丛枝菌根真菌处理滇重楼新根茎元素与土壤元素相关性分析Table 5 The correlation analysis of the new tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表6 不同丛枝菌根真菌处理滇重楼叶中元素与土壤元素相关性分析Table 6 The correlation analysis of leaf elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

由表7可知，滇重楼茎与土壤中5种元素存在的相关性表现为：滇重楼茎中钾与钙存在显著正相关(r=0.453，P<0.05)，滇重楼茎中的钾与土壤中的磷呈显著负相关(r=-0.384，P<0.05)，土壤中的钾和钙呈显著负相关(r=-0.438，P<0.05)，土壤中的镁与滇重楼茎中的镁呈显著负相关(r=-0.403，P<0.05)，与土壤中的钙呈显著正相关(r=0.446，P<0.05)。茎中钾含量与钙含量呈正相关，可能与钾具有使茎干坚韧，增强植株抗机械损伤、抗虫害能力有关。在采收期，S3、S6、S8处理组的土壤中的钙含量较高，可以为滇重楼生长提供较多的钙，从而提高滇重楼的抗逆性，且叶中的钙含量与氮含量具有正相关性。

表7 不同丛枝菌根真菌处理滇重楼茎中元素与土壤元素相关性分析Table 7 The correlation analysis of stem elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

3 讨论与结论

接种不同AM真菌菌剂处理能够不同程度的影响滇重楼及栽培土壤中营养元素的吸收及蓄积。氮、磷、钾是植物生长发育所必需的元素，其体内含量分布能反映植物对元素的分配及相互作用的关系[21]。接种不同组合AM真菌菌剂后，不同元素的含量在不同生长期呈现动态变化过程，其中S8处理组T1时期新、老根茎和叶，T2时期新根茎和叶以及T4时期新、老根茎中氮的含量增加；S8处理组T1时期新根茎中磷的含量增加(最高为6.289 g/kg)，推测S8处理组的AM真菌可以促进滇重楼吸收土壤中的氮、磷元素来提升产量及品质。与Li等[22]研究一致，增施氮肥和磷肥可增加滇重楼的产量和皂苷含量。S8处理组T4时期老根茎中钾含量较高，为12.715 g/kg；而且Wang等[23]报道土壤中的钾有利于滇重楼根茎中总皂苷和多糖的合成与积累，对其影响可能是通过滇重楼不同部位含钾量来实现。S8处理组T1和T3时期茎和叶以及T4时期新、老根茎的钙含量增加；T1、T2和T4时期新根茎的镁的含量增加(最高为28.142 g/kg)。钙不仅是植物细胞壁和细胞膜等结构的重要组成，还能够有效缓解各种生物和非生物胁迫对植物的威胁，提高植物抗逆性，对生长发育、成熟及衰老起着重要作用[24]。

药用植物的品质可以间接反映土壤质量和肥力，根际土壤微生态的变化也会影响药用植物的质量。AM真菌等微生物的含量能够引起土壤基质环境的变化，对微生物群落组成结构产生重要影响[25]。本研究发现，除S6、S8处理组滇重楼的新根茎、老根茎和叶中氮的含量显著升高，S8和S1处理组滇重楼的新根茎的磷含量比其他处理组高(最高可达到6.289 g/kg)之外，不同处理组土壤中的氮、磷、钾和镁元素的变化量不大。不同处理组土壤中的钙含量有显著性增多，尤其S8处理组的土壤中钙的含量明显比对照组高。因此，接种不同丛枝菌根真菌混合菌剂能有效改变滇重楼药材不同部位氮、磷、钾、钙、镁含量，促进滇重楼对营养元素的吸收。同时也可改变土壤中营养元素的释放，这与AM真菌菌根对营养物质竞争的优势作用研究相一致[26]。

相关性分析表明，滇重楼老根茎中N的吸收与Ca、Mg的吸收，新根茎中N的吸收与P、Mg的吸收，P的吸收与K的吸收，叶中的N的吸收和茎中K的吸收与Ca的吸收呈显著协同作用，老根茎中Ca的吸收与土壤中Ca、Mg的吸收呈显著负相关作用，茎中的K的吸收与土壤中P的吸收，茎中Mg的吸收与土壤中Mg的吸收呈负相关作用。与Zhang等[11]推测的多种营养元素在滇重楼生长过程中的积累可能存在竞争或协同两种效应相一致。滇重楼的老根茎中氮、钙和镁的吸收三者之间具有协同作用，滇重楼叶中磷的含量随土壤中钙含量的增加而增加，而钙和磷之间存在复杂的交互作用且具有物种特异性，高钙可增加豆科植物对磷的吸收但抑制小麦、番茄等对磷的吸收[27,28]。

综上所述，S8处理组的6种AM真菌:微白巨孢囊霉(G.albida)、巨大巨孢囊霉(G.gigantea)、美丽盾巨孢囊霉(S.calospora)、亮色盾巨孢囊霉(R.fulgida)、根内球囊霉(R.intraradices)、近明球囊霉(C.claroideum)作为滇重楼生物菌肥的优良菌种，为生物菌肥的研发奠定基础。本研究结果显示9种不同AM真菌菌剂的组合可以不同程度的影响营养元素的含量转移及蓄积，但是要想筛选最优的混合菌剂还需要进一步的实验验证其接种的比例及发酵液的成分等，以期为滇重楼的生物菌肥的研发和应用奠定理论基础，以利于改变滇重楼营养元素的吸收与蓄积，提升滇重楼的品质。