基于标准汤剂的芸香科常用中药饮片特征图谱及含量测定研究

李国卫，邱韵静，索彩仙，童培珍，何嘉莹，杨晓东，孙冬梅，胡绮萍

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山 528244

中药陈皮、青皮、枳壳、化橘红、佛手均属芸香科柑橘属植物，为临床常用理气类中药。其中个青皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果；四花青皮为芸香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培变种的干燥未成熟果实的果皮；陈皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮；枳壳为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实；化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮；佛手为芸香科植物佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle的干燥果实[1]。该属中药具有理气健脾、化痰等相似功效[2]，主要化学成分为橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黄酮类[3]。目前对于芸香科常用中药多集中在药材含量测定或指纹图谱研究[4-6]或单一单味标准汤剂质量研究[7-9]。由于临床多以汤剂、颗粒剂等形式服用，临床制剂已经失去原饮片所具有的显微与性状鉴别特征，即无法从药材的形状、大小、色泽、表面、质地、气、味等特征进行检查与鉴别，不利于临床用药质量的控制。本研究以个青皮、四花青皮、陈皮、枳壳、化橘红及佛手等芸香科柑橘属饮片标准汤剂为研究对象，建立多指标含量测定和UPLC特征图谱方法，研究其质量的差异性，以期对标准汤剂和颗粒剂等制剂过程中的饮片、中间体、成品的质量控制和化学成分的量值传递研究提供参考。

1 仪器与试药

赛默飞Q Exactive Focus Orbitrap高分辨质谱(美国赛默飞公司)；Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；ME204E型万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TRL-0.5真空冷冻干燥机(大连双瑞科技有限公司)。甲醇为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

柚皮苷对照品(批号：110722-201714，含量93.4%)、新橙皮苷对照品(批号：111857-201804，含量99.4%)、橙皮苷对照品(批号：110721-201818，含量96.20%)，由中国食品药品检定研究院提供；芸香柚皮苷对照品(批号：wkq19041908，含量98.0%)、水合橙皮内酯对照品(批号：wkq20031904，含量98.0%)、川陈皮素对照品(批号：wkq20031701，含量98.0%)、橘红素对照品(批号：wkq16011401，含量98.6%)，由四川维克奇生物科技有限公司提供。实验所用药材均经广东一方制药有限公司质量中心鉴定，样品具体信息见表1。

表1 样品详情信息表Table 1 Information of samples

续表1(Continued Tab.1)

2 方法与结果

2.1 标准汤剂的制备

取饮片100 g，加水煎煮两次，第一次煎煮加入10倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后改文火再煎煮30 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷却；第二次煎煮加7倍量水，武火煮沸后改文火再煎煮25 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷却；合并两次滤液，减压浓缩至150 mL流浸膏，分装至西林瓶，真空冷冻干燥，即得。各品种出膏率见表2。

2.2 色谱条件

采用Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸水为流动相B，梯度洗脱：0～7 min，15%A→25%A；7～8 min，25%A→40%A；8～10 min，40%A→45%A；10～13 min，45%A→60%A；13～15 min，60%A→15%A。，流速为0.4 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为320 nm；进样量2 μL。

2.3 质谱条件

除流动相B为0.05%甲酸外，余下条件同“2.2”项。正离子模式(ESI+)，喷雾电压为3.50 kV；毛细管温度为300 ℃；全扫描模式为Full Scan；扫描范围：100.0～1 500.0m/z。

2.4 对照品溶液制备

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为62.70、57.68、51.28、56.01、57.77、55.17 μg/mL的混合对照品溶液。

2.5 供试品溶液制备

取本品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(250 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各供试品生药浓度见表2。

表2 各品种出膏率与生药浓度表Table 2 Rate of extract and crude drug concentration of different varieties

2.6 特征图谱方法学研究

2.6.1 精密度

取同一批化橘红(批号：H3)和枳壳(批号：ZQ7)，分别按“2.5”项下方法制备供试品溶液和“2.2”项下的色谱条件连续进样6次，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算各自共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性

取同一批化橘红(批号：H3)和枳壳(批号：ZQ7)，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h 按“2.2”项色谱条件进样测定，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.3 重复性

分别取同一批化橘红(批号：H3)和枳壳(批号：ZQ7)样品粉末6份，按“2.5”项下方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.7 特征图谱分析及评价

2.7.1 特征图谱的建立及共有峰归属

采用国家药典委员会“中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012.0版本)”对芸香科柑橘属常用饮片的75批标准汤剂样品UPLC特征图谱进行结果分析：个青皮饮片标准汤剂共确定8个共有峰(图1)，四花青皮饮片标准汤剂确定8个共有峰(图2)，陈皮饮片标准汤剂确定7个共有峰(图3)，枳壳饮片标准汤剂确定10个共有峰(图4)，化橘红饮片标准汤剂确定6个共有峰(图5)，佛手饮片标准汤剂确定5个共有峰(图6)。除化橘红饮片标准汤剂外，其余5个饮片标准汤剂均有4号峰(橙皮苷)，其分离度较好，为药材中抗炎、抗氧化、抗菌、保护心血管系统的主要成分之一[8-9]，故以4号峰(橙皮苷)为参照峰(即为S峰)；化橘红饮片标准汤剂则以2号峰(柚皮苷)为参照峰。通过对照品对照，共指认7个特征峰，分别为1号峰芸香柚皮苷、2号峰柚皮苷、4号峰橙皮苷、5号峰新橙皮苷、6号峰水合橙皮内酯、16号峰川陈皮素、17号峰橘皮素(图7)，芸香科柑橘属常用饮片标准汤剂中含有色谱峰详细信息如下(见表3)。

表3 芸香科标准汤剂UPLC色谱峰信息比较结果Table 3 Comparison of UPLC chromatographic peak information of standard decoction of Rutaceae

图1 9批个青皮标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.1 Common UPLC peak mode of 9 batches of Citri Reticulatae Pericarpium Viride standard decoction

图2 15批四花青皮标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.2 Common UPLC peak mode of 15 batches of Citri Reticulatae Pericarpium Viride standard decoction

图3 9批陈皮标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.3 Common UPLC peak mode of 9 batches of Citri Reticulatae Pericarpium standard decoction

图4 17批枳壳标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.4 Common UPLC peak mode of 17 batches of Aurantii Fructus standard decoction

图5 12批化橘红标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.5 Common UPLC peak mode of 12 batches of Citri Grandis Exocarpium standard decoction

图6 13批佛手标准汤剂UPLC共有峰模式Fig.6 Common UPLC peak mode of 13 batches of Citri Sarcodactylis Fructus standard decoction

图7 芸香科标准汤剂样品共有峰对照品归属图

2.7.2 特征峰质谱指认

采用高分辨质谱采集6个样品的质谱数据，通过Compound Discoverer 3.0软件对所有特征峰进行指认，共指认出其中的16个色谱峰，其中野漆树苷、佛手酚、7-羟基香豆素、5,7-二甲基香豆素、异橙黄酮、异橙皮内酯、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、去甲基川陈皮为新确认成分，结果见图8、表4。

图8 6种芸香科标准汤剂质谱TIC图Fig.8 TIC of Six standard decoction samples

表4 质谱指认结果表Table 4 LC-MS identification results

续表4(Continued Tab.4)

2.7.3 相似度评价结果

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”分别对G1～G9、SH1～SH15、C1～C9、ZQ1～ZQ17、H1～H12、FS1～FS13共75批饮片标准汤剂样品UPLC特征图谱进行数据处理，分别以个青皮、四花青皮、陈皮、枳壳、化橘红、佛手共有模式作为对照特征图谱，计算相似度系数，9批个青皮饮片标准汤剂的相似度均在0.791～0.998之间，15批饮片四花青皮标准汤剂的相似度均在0.784～0.999之间，9批陈皮饮片标准汤剂相似度均在0.996～0.999之间，17批枳壳饮片标准汤剂相似度均在0.986～0.999之间，12批化橘红饮片标准汤剂的相似度均在0.962～1.000以上，13批佛手饮片标准汤剂的相似度均在0.909～0.999以上，相似度结果说明芸香科同一基原的柑橘属药材不同批次间的化学成分具有较好的一致性，结果见表5。

表5 芸香科标准汤剂相似度评价结果Table 5 Results of similarity evaluation

续表5 (Continued Tab.5)

2.7.4 聚类分析

运用SPSS 20.0软件对75批饮片标准汤剂样品中18个共有峰的峰面积为数据进行系统聚类，采用组内平均联接法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，结果显示75批饮片标准汤剂被分为4类，结果见图9。化橘红H1～H12聚为一类，枳壳ZQ1～ZQ15聚为一类，佛手FS1～FS13聚为一类，个青皮G1～G9、四花青皮SH1～SH15及陈皮C1～C9聚为一类。结果显示不同品种的枳壳、化橘红、佛手能各单独的聚为一类，而同一品种(橘)不同成熟期的个青皮、四花青皮、陈皮无法通过聚类分析进行划分，说明不同品种间饮片标准汤剂样品具有明显差异，同一品种间不同成熟期饮片标准汤剂样品无明显差异。

图9 75批标准汤剂样品聚类分析结果Fig.9 Cluster analysis results of 75 batches of standard decoction

2.7.5 主成分分析

将不同芸香科柑橘属标准汤剂样品的共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件进行主成分分析。由主成分分析结果可知，前3个主成分的累积贡献率为84.48%，前3个成分载荷值分别为8.98、3.95、2.35，说明前3个主成分基本能反映标准汤剂样品的主要特征(见表6、图10)。以前3个主成分建立坐标系，构建样品的主成分分析得分图(见图11)。由得分图可知，化橘红、佛手及枳壳各聚为一类，个青皮、四花青皮及陈皮聚为一类，结果与聚类分析一致。

图10 主成分方差贡献率Fig.1 Variance contribution rate of principal components

图11 主成分分析得分Fig.11 Principal components analysis score

表6 主成分方差贡献率Table 6 Variance contribution rate of principal components

2.7.6 偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

为了进一步比较同一品种(橘)不同成熟期(个青皮、四花青皮及陈皮)化学成分的差异和寻找三者之前的差异性化合物，将个青皮、四花青皮及陈皮饮片标准汤剂的峰面积为变量进行了OPLS-DA建模分析。OPLS-DA模型中，R2X为0.830，Q2为0.839，均大于0.5，说明建立的模型稳定可靠。由OPLS-DA得分图可知(见图12)，个青皮、四花青皮及陈皮饮片标准汤剂明显分为三类。通过变量重要性投影值(variable importance for the projection，VIP)筛选出三者间化学成分差异的主要标志性成分(见图13)。以VIP值大于1作为标准筛选，贡献依次由大到小的4个变量为：峰4、峰5、峰1、峰7。通过对照品对照，指认出3个成分，分别为峰4橙皮苷，峰5新橙皮苷，峰1芸香柚皮苷。

图12 不同成熟期橘OPLS-DA得分Fig.12 OPLS-DA score of different stages of C.reticulata

图13 不同成熟期橘VIP值Fig.13 VIP value of different stages of C.reticulata

2.8 含量测定研究

基于上述特征图谱分析结果，为进一步评价芸香科柑橘属常用饮片标准汤剂的质量，对已归属的7个化学成分进行定量分析，以期区分不同芸香科柑橘属标准汤剂之间的差异。

2.8.1 精密度考察

取“2.4”项下混合对照品，按“2.2”项下的色谱条件连续进样6次，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘红素7个成分峰面积RSD分别为0.52%、1.03%、1.04%、0.68%、0.44%、0.55%、0.33%，表明精密度良好。

2.8.2 稳定性考察

取枳壳样品(ZQ7)粉末约0.1 g，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘红素7个成分峰面积RSD分别为1.58%、1.64%、1.43%、1.25%、1.63%、1.05%、1.66%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8.3 线性关系

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为336.63、2 059.28、221.61、528.81、69.19、219.72、256.44 μg/mL的混合对照品溶液，加甲醇稀释成6个不同浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表7。

表7 回归方程及线性范围Table 7 Regression equation and linear range

2.8.4 重复性试验

取枳壳样品(ZQ7)粉末约0.1 g，平行6份，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的的色谱条件测定，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘红素7个成分含量RSD分别为1.58%、0.82%、0.66%、1.09%、1.32%、1.05%、1.66%，表明该方法重复性良好。

2.8.5 加样回收率试验

取已知含量的枳壳样品(ZQ7)粉末约0.05 g，精密称定，平行6份，按1∶1加入对照品，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算各成分的加样回收率。测得芸香柚皮苷平均回收率为103.83%，RSD为0.71%；柚皮苷平均回收率为101.72%，RSD为1.27%；橙皮苷平均回收率为103.98%，RSD为1.77%；新橙皮苷平均回收率为99.87%，RSD为2.55%；水合橙皮内酯平均回收率为100.91%，RSD为3.22%；川陈皮素平均回收率为100.84%，RSD为1.30%；橘红素平均回收率为102.94%，RSD为0.89%；结果表明7个成分回收率良好。结果见表8。

表8 加样回收率考察结果Table 8 Accuracy inspection results

续表8(Continued Tab.8)

2.8.6 样品测定结果

精密吸取对照品溶液和75批供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，含量结果见表9。结果显示，不同芸香科柑橘属标准汤剂样品的7个成分含量差异明显，RSD在38.97%～91.81%。通过多批次样品测定可知，芸香柚皮苷在个青皮和枳壳饮片标准汤剂中能检出，且两者含量均值无明显区别；柚皮苷在枳壳和化橘红中能检出，化橘红含量均值高于枳壳；橙皮苷除化橘红外其余饮片标准汤剂均能检出，含量均值由大到小为：四花青皮>陈皮>个青皮>枳壳；新橙皮苷在个青皮、四花青皮及枳壳中均能检出，含量均值由大到小为：枳壳>个青皮>四花青皮>枳壳；水合橙皮内酯在枳壳和、化橘红及佛手中检出，含量均值由大到小为：枳壳>化橘红>佛手；川陈皮素和橘红素除化橘红及佛手外，其余各饮片标准汤剂均能检出，含量均值由大到小为：陈皮>四花青皮>个青皮>枳壳(见图14)。

表9 含量测定结果Table 9 Content determination results(mg/g)

续表9(Continued Tab.9)

续表9(Continued Tab.9)

图14 含量均值对比Fig.14 Comparison of the average content

3 讨论与结论

中药饮片标准汤剂是以中医药理论为指导，临床应用为基础，经过煎煮、固液分离、浓缩和冷冻干燥制备而成，为中药质量标志物研究的关键物质，是衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的物质基础[10-13]。芸香科柑橘属饮片在临床使用上各有侧重，如青皮长于疏肝破气，消积化滞，而成熟度更高的陈皮则善于理气健脾，燥湿化痰，但两者药材的化学成分较为接近，因此，本研究基于标准汤剂对对不同芸香科柑橘属饮片进行分析，为临床用药提供参考依据。

本研究建立了芸香科柑橘属饮片标准汤剂UPLC特征图谱及多指标含量测定方法，并对不同来源的芸香科柑橘属标准汤剂样品进行分析。特征图谱分析结果显示，不同来源芸香科柑橘属标准汤剂样品特征图谱的色谱峰数目存在差异，可通过特征图谱可直观区分6种芸香科柑橘属。聚类分析及主成分分析显示，化橘红、枳壳、佛手可单独的聚为一类，不同成熟期的橘(个青皮、四花青皮、陈皮)存在交叉交集的情况，不同种间差异较大，同种样品间差异较小。为了进一步区分不同成熟期的橘(个青皮、四花青皮、陈皮)间的差异，采用偏最小二乘法-判别分析进行分析，能对三者进行识别与聚类，并确认了橙皮苷、新橙皮苷、芸香柚皮苷和峰7是质量差异的主要物质，推测上述成分含量与成熟期可能存在关联。

本研究在特征图谱基础上，对不同芸香科柑橘属标准汤剂样品中7个主要指标性成分进行含量测定，结果显示，不同样品间的7个成分含量差异明显，RSD在38.97%～91.81%。化橘红柚皮苷含量均值高于枳壳；橙皮苷除化橘红外的样品均能检出，含量均值大小为：四花青皮>陈皮>个青皮>枳壳；新橙皮苷在个青皮、四花青皮及枳壳中能检出，含量均值大小为：枳壳>个青皮>四花青皮；水合橙皮内酯在枳壳、化橘红及佛手中能检出，含量均值大小为：枳壳>化橘红>佛手；川陈皮素和橘红素在除化橘红及佛手外，其余样品均能检出，含量均值大小为：陈皮>四花青皮>个青皮>枳壳。含量测定结果与特征图谱结果一致，不同品种间的样品既存在成分上的差异，亦存在含量上的差异，可能是导致其临床上功效各有侧重的原因之一。

本研究建立的UPLC特征图谱方法较全面地反映了芸香科柑橘属饮片标准汤剂的化学成分，并同法测定了已归属的7个特征性成分，分析方法迅速简便，利用化学计量分析有效区分芸香科柑橘属常用饮片标准汤剂，可为芸香科柑橘属饮片标准汤剂及其相关制剂质量评价提供依据。