白莱菔纳米乳的制备及功效评价

张立秋, 朴鑫淼, 韩美子, 施溯筠

( 延边大学 药学院， 吉林 延吉 133002 )

研究[1]表明，纳米乳作为一种新型的经皮传递体系，不但可以增强活性成分的渗透，还可以提高活性成分的稳定性和利用率，进而达到控制释放与靶向的作用.莱菔(RaphanussativusL.)为十字花科植物，主要分为白莱菔和青莱菔.莱菔的根部、叶和种子均可药用，并且含有丰富的维生素C、花青素和总酚等生物活性物质，具有良好的抗氧化及延缓衰老等功效[2-3].目前，针对莱菔的研究大都集中在其种子部分(莱菔子)，且研究显示莱菔子对于治疗胃肠疾病具有一定疗效[4-5].目前为止，未发现以莱菔根部制成的纳米乳制剂作为化妆品的研究，为此本文制备了一种白莱菔纳米乳，并对其保湿及抗氧化能力进行了测试.

1 实验仪器与材料

752N紫外分光光度计， 日本科学仪器有限公司； FA - 2004电子天平，上海精天电子仪器有限公司； JB - 4定时双向数显恒温磁力搅拌器，常州恒隆仪器有限公司； R20ID旋转蒸发器，上海豫康科教仪器设备有限公司； HH - 6恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司； DHG - 9023A型电热恒温鼓风干箱，常州诺基仪器有限公司； ZF - SK01A本草精华萃取仪，颍上卓越电子商务有限公司； Zeta电位用粒度分析仪，上海力晶科学仪器有限公司； HT7700日立透射电子显微镜,日立高新技术贸易有限公司.

苯氧乙醇，浙江圣效有限公司；乙基已基甘油，临沂绿森有限公司；聚乙二醇400(PEG - 400)、甘油，山东优索化工科技有限公司； DPPH(1,1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼)， 北京华越洋生物科技有限公司； 无水乙醇，沈阳市试剂三厂；橄榄油，丹东安康有限公司；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，临沂绿森有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚(EL - 40)，巴斯夫有限公司； 1,2- 丙二醇，美国陶氏有限公司；吐温80， 广州润华有限公司；白莱菔、青莱菔均购于延吉西市场.

2 实验方法

2.1 莱菔提取液的制备

取适量的白莱菔、青莱菔的芯部和皮部，用萃取仪提取30 min(水为溶剂)后将得到的白莱菔和青莱菔的芯部提取液(0.24 g/mL)和皮部提取液(0.14 g/mL)冷藏备用[6].

2.2 DPPH自由基清除法

根据文献[7]中的配置方法配制0.1 mmol/L浓度的DPPH乙醇溶液(现用现配)，避光保存.按照表1所示，将两种莱菔不同部位的提取液和DPPH乙醇溶液分别加入至试管中，摇匀；在室温避光环境下反应30 min，然后在517 nm波长处测定吸光度.平行测定3次，取平均值计算各组的自由基清除率(公式为R=[1-(Ai-A0)/Aj]×100%[8]，其中Ai为样品吸光度，Aj为对照组吸光度，A0为空白组吸光度).

表1 DPPH自由基试验加样表

2.3 乳液基质的筛选及制备

基质配方通过查阅文献[9-11]和实验获得.配方主要包括：表面活性剂(A相)、油相(B相)、助表面活性剂(C相)及水相(D相)，如表2所示.配方的具体比例通过实验筛选获取.

表2 乳液的基质配方

2.3.1表面活性剂的筛选

以EL - 40、吐温80作为备选表面活性剂，以IPM为油相，以1,2- 丙二醇为助表面活性剂.将备选表面活性剂和助表面活性剂按质量比4∶1混合制成混合乳剂，然后将混合乳剂与油相再分别按1∶9、 2∶8、 3∶7、 4∶6、 5∶5、 6∶4、 7∶3、 8∶2、 9∶1的质量比进行混合.在磁力搅拌器搅拌(转速为650 r/min、温度为25 ℃)下，向混合体系中逐滴加水，并记录混合体系由澄清变为浑浊或由浑浊变为澄清的临界点.利用Origin 8.0软件绘制伪三元相图，并以形成的纳米乳区域面积确定表面活性剂[12].

2.3.2油相的筛选

以IPM、橄榄油作为备选油相，以1,2- 丙二醇为助表面活性剂，以2.3.1筛选出的最佳成分为表面活性剂.将筛选的表面活性剂和助表面活性剂按质量比4∶1混合制成混合乳剂，然后将混合乳剂与备选油相分别按1∶9、 2∶8、 3∶7、 4∶6、 …、 8∶2、 9∶1的质量比进行混合.按2.3.1条件绘制伪三元相图，并以形成的纳米乳区域面积确定油相.

2.3.3助表面活性剂的筛选

以1，2- 丙二醇、PEG - 400作为备选助表面活性剂，以2.3.1和2.3.2筛选出的最佳成分作为表面活性剂和油相.将筛选的表面活性剂和备选的助表面活性剂按质量比4∶1混合制成混合乳剂，然后将混合乳剂与备选油相分别按1∶9、 2∶8、 3∶7、 …、 8∶2、 9∶1的质量比进行混合.按2.3.1条件绘制伪三元相图，并以形成的纳米乳区域面积确定助表面活性剂.

2.3.4表面活性剂与助表面活性剂质量比(Km)的筛选

以Km=2、Km=3、Km=4作为备选的混合乳剂比例，按上文筛选出的最佳表面活性剂、助表面活性剂、油相进行Km值的筛选.利用Origin 8.0软件绘制伪三元相图，并以形成的纳米乳区域面积确定Km值.

2.3.5白莱菔纳米乳的制备

采用水相滴定法制备纳米乳，以浓度为0.04 g/mL的白莱菔皮提取液为水相，以IPM为油相，以EL - 40、吐温80(复配比2∶1)为表面活性剂，以1，2- 丙二醇为助表面活性剂.在Km=4的条件下，将油水两相进行混合，然后在室温下用恒温磁力搅拌器持续搅拌30 min (650 r/min)即得白莱菔纳米乳.

2.4 纳米乳的表征

1)纳米乳类型的鉴别.采用染色法对白莱菔纳米乳进行类型鉴定[13].取等量所制备的白莱菔纳米乳，然后向其中添加相同量的甲基红与亚甲基蓝染料，并观察两种染料的扩散速率.如果亚甲基蓝扩散速度较快，则说明乳液是O/W型纳米乳，如果甲基红扩散速度较快，则说明乳液是W/O型纳米乳.

2)纳米乳的粒径及形态特征的测定.采用Zeta电位分析仪测定白莱菔纳米乳的粒径分布及聚合物分散性指数，采用透射电子显微镜观察纳米乳的形态特征[14].

2.5 斑贴试验

斑贴试验采用《化妆品卫生规范》[15]中的人体皮肤斑贴试验方法.受试者选取符合标准[16]的志愿者30人(19～28岁年龄段)，其中女性20人，男性10人.取0.15 mL白莱菔纳米乳液和市售乳液分别滴加在斑试器所附的滤纸片上，然后将斑试器用无刺激的胶带贴敷于受试者的前臂内侧进行测试(贴敷时间分别为24 h和48 h).试验中皮肤不良反应分级标准见表3.

表3 皮肤不良反应的分级标准

2.6 纳米乳的稳定性实验

1)耐热耐寒性实验.将等量的纳米乳液置于3个15 mL的离心管中，并分别在-10、-5、 25、 40 ℃环境下放置24 h，恢复室温后观察纳米乳液是否变浑浊或产生分层等现象.每个温度环境下重复3次.

2)离心稳定性实验.将等量的纳米乳液置于3个15 mL的离心管内，并分别在1 000、2 000、3 000 r/min转速下离心.离心结束后，观察纳米乳液是否变浑浊或产生分层、破乳等现象.

3)稀释稳定性实验.将等量的纳米乳液置于3个15 mL的离心管内，稀释的倍数分别为5倍、10倍、15倍，并观察纳米乳液是否变浑浊或产生分层、破乳等现象.

4)长期保存稳定性实验.将等量的纳米乳液置于3个15 mL的离心管内，在25 ℃室温下保存1个月，并在保存的3个月内持续观察纳米乳液是否变浑浊或产生分层、破乳等现象[17].

2.7 纳米乳的功效评价

1)受试者要求及样品的使用.受试者选择符合标准[16]的8名志愿者(年龄范围为18～28岁).在测试之前，将受试者的左右前臂洗净晾干，然后在温度为(25±1) ℃，相对湿度为(60±1)%的环境下稳定0.5 h.在受试者的左右前臂内侧划分出4 cm×4 cm的测试区域，并将待测乳液均匀地涂抹于受试部位((2±0.1) mg/cm2).涂抹时不同样品不得交叉使用.

2)皮肤含水率与皮肤细纹程度的测定.皮肤含水率与皮肤细纹程度使用CM825皮肤水分测试探头测定.测定时每个测试点平行测3次，取平均值[18].皮肤含水率W的计算公式为：

W=(Wi-W0)/W0×100%.

式中Wi为涂抹乳液i时间后的皮肤含水率，W0为涂抹乳液前的皮肤含水率.

3 结果与分析

3.1 DPPH清除率的测定

图1为不同浓度、不同部位的两种莱菔溶液对DPPH自由基的清除率.由图1可以看出，白莱菔和青莱菔的皮部、芯部水提液在20～240 mg/mL浓度范围内时其对自由基的清除率随浓度的增加而增大，其中白莱菔皮提取液浓度在40 mg/mL时最先达到平衡，且对自由基的清除率(84.95%)优于青莱菔提取液.因此本文选取白莱菔皮提取液制备乳液.

图1 不同质量浓度、不同部位的两种莱菔溶液对DPPH自由基的清除率

3.2 乳液基质的筛选结果

1)表面活性剂的筛选结果.图2—图5是EL-40、吐温80及二者以不同比例复配作为表面活性剂的伪三元相图.由图可以看出，将EL-40和吐温80以质量比2∶1进行复配时，所形成的纳米乳区域面积最大，因此本文选择复配比为2∶1的EL - 40、吐温80作为表面活性剂.

图2 EL - 40为表面活性剂时的伪三元相图

图3 吐温80为表面活性剂时的伪三元相图

图4 复配质量比为1∶1的EL - 40和吐温80为表面活性剂时的伪三元相图

图5 复配质量比为2∶1的EL - 40和吐温80为表面活性剂时的伪三元相图

2)油相的筛选结果.实验显示，以橄榄油为油相制备纳米乳时存在乳化分层破乳等现象，即无法制得澄清的纳米乳，而采用IPM可以制得澄清的空白纳米乳，因此本文采用IPM作为油相.

3)助表面活性剂的筛选结果.图6—图7是PEG - 400和1,2- 丙二醇作为助表面活性剂的伪三元相图.由图可以看出，PEG - 400作为助表面活性剂时形成的纳米乳区域面积小于1，2- 丙二醇作为助表面活性剂时形成的纳米乳区域面积，因此本文选择1，2- 丙二醇作为助表面活性剂.

图6 PEG - 400为助表面活性剂时的伪三元相图

图7 1,2 - 丙二醇为助表面活性剂时的伪三元相图

4)Km值的筛选结果.图8 — 图10为纳米乳Km值的筛选结果.由图可以看出，Km=4时纳米乳形成的区域面积明显大于Km=3和Km=2时所形成的纳米乳区域面积，因此本文选择Km=4作为制备纳米乳的最佳指数.

图8 Km=2时的伪三元相图

图9 Km=3时的伪三元相图

图10 Km=4时的伪三元相图

3.3 纳米乳的表征

1)纳米乳类型的鉴别.图11为甲基红染料、亚甲基蓝染料在白莱菔纳米乳中的扩散图.由图可以看出，亚甲基蓝染料在白莱菔纳米乳中的扩散速度较快，由此表明本文所制备的白莱菔纳米乳为O/W型纳米乳.

图11 甲基红染料、亚甲基蓝染料在白莱菔纳米乳中的扩散情况

2)纳米乳粒径的测定.表4为不同样品的白莱菔纳米乳的粒径.由表4可以看出，纳米乳粒径平均为53.05 nm，聚合物分散性指数(PDI)平均值为0.357， 该结果符合纳米乳的基本要求(粒径200 nm以内， PDI在0.5左右).

表4 纳米乳粒径的参数

3)纳米乳的形态特征.用透射电子显微镜观察纳米乳，结果如图12所示.由图12可以看出，纳米乳呈圆球形，均匀分散，无聚团黏连等现象，状态良好.

图12 透射电子显微镜下的纳米乳形态

3.4 斑贴试验

根据化妆品卫生法规[13]的相关标准对白莱菔纳米乳液和市售乳液进行封闭贴剂测试，实验结果见表5.由表5可知，白莱菔纳米乳液成品组对人体无不良反应，且优于市售乳液Ⅰ，由此表明白莱菔纳米乳具有较好的安全性.

表5 人体封闭式斑贴测试结果

3.5 纳米乳的稳定性实验与功效评价

3.5.1纳米乳的稳定性实验

1)耐热耐寒性实验.表6为温度对纳米乳的稳定性影响.由表6可以看出，纳米乳液经-10、-5、 25、 40 ℃的耐热耐寒试验后依然保持澄清状态，由此表明纳米乳在不同温度下均具有良好的稳定性.

表6 纳米乳的耐热耐寒性实验结果

2)离心稳定性实验.表7为不同转速对纳米乳的稳定性影响.由表7可以看出，纳米乳液在1 000、 2 000、 3 000 r/min转速下均保持澄清、无分层、破乳等现象，表明纳米乳在不同的转速下均具有良好的稳定性.

表7 纳米乳的离心稳定性实验结果

3)稀释稳定性实验.表8为不同的稀释倍数对纳米乳的稳定性影响.由表8可以看出，纳米乳液在稀释5倍、10倍、15倍后均保持澄清、无分层、破乳等现象，由此表明纳米乳液在不同的稀释倍数条件下均具有良好的稳定性.

表8 纳米乳的稀释稳定性实验结果

4)长期保存稳定性实验.表9为不同存储时间对纳米乳的稳定性影响.由表9可以看出，纳米乳液在25 ℃室温下保存3个月时始终保持澄清、无分层、破乳等现象，由此表明纳米乳具有良好的长期保存稳定性.

表9 纳米乳的长期保存稳定性实验结果

3.5.2功效评价

1)保湿性能的测定.以市售产品作为对照组，实验制备的乳液作为样品组对纳米乳的保湿性能进行评定，结果如图13所示.由图可以看出：在0～0.5 h范围内样品组的皮肤水分含量变化率明显高于市售产品组；当大于0.5 h后，样品组与市售产品组的皮肤水分含量变化率基本持平，说明所制备的纳米乳的保湿效果与市售产品的保湿功效相当.

图13 莱菔纳米乳对皮肤角质层含水量的影响

2)皮肤细纹程度的测定.以市售产品组和未涂乳液的空白组作为对照组，以实验制备的白莱菔纳米乳液作为样品组测定各组分对皮肤细纹的去除效果，结果如图14所示.由图14可以看出，使用白莱菔纳米乳液及市售乳液28 d时，皮肤纹理测定值明显低于空白组，且样品组略低于市售产品组，由此说明所制备的白莱菔纳米乳对淡化细纹具有良好的功效.

图14 不同组分对皮肤细纹的去除效果

4 结论

经实验筛选，本文以EL - 40和吐温80(复配质量比为2∶1)作为表面活性剂、 IPM为油相、 1,2- 丙二醇为助表面活性剂、超纯水为水相作为基质制备了白莱菔纳米乳.对白莱菔纳米乳液的理化性能和抗氧化性能进行测试显示，其稳定性、安全性指标均符合国家化妆品相关规定，且具有良好的保湿及抗氧化性能，因此本文制备的白莱菔纳米乳具有良好的开发利用价值.