香叶木素对小鼠缺氧耐受和抗疲劳影响的实验研究

杨正蓉，李涛，李成良，卢镇江，宋梦强，郑倩

(1.川北医学院，四川 南充 637100；2.川北医学院基础医学院机能实验中心，四川 南充 637100)

0 引言

香叶木素主要从菊花、留兰香、蜘蛛香等天然药物和柠檬、柑橘、花生等天然黄酮类化合物果实中提取的黄酮类化合物[1]。香叶木素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎及抗菌等多种药理活性[2]。有实验证明其对可保护小鼠缺血再灌注诱导的急性肾损伤[3]，同时可保护视网膜功能，机制与减少DNA损伤和降低氧化应激反应有关[4]。近期有实验结果表明香叶木素可通过增加SOD活性和减少MDA含量从而对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用[5]。目前香叶木素对耐缺氧和抗疲劳的作用及其机制的报道较少，本课题通过不同浓度香叶木素对小鼠进行灌胃，建立低张性缺氧、亚硝酸钠缺氧、急性脑缺血性缺氧模型，观察各组小鼠存活时间，同时观察香叶木素对小鼠负重游泳和爬杆实验的时间变化，并检测小鼠肝脏中S0D、MDA的变化，以此探讨香叶木素对耐缺氧和抗疲劳的作用及其相应机制，为开发香叶木素的应用提供理论基础和实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物

选择健康KM成年小鼠75只，体重为24-28g，全为雄性，小鼠由川北医学院动物实验中心提供。饲养在温度为26℃的环境中。普通饲料由川北医学院动物实验中心动物房提供，常温避光保存。

1.1.2 分组

将小鼠随机分成3组：对照组(NOR)、低剂量组香叶木素10mg/(kg·d)、高剂量组香叶木素50mg/(kg·d)，香叶木素组每天16时给小鼠灌胃，连续 25d。对照组灌胃生理盐水，按体重于每天16时灌胃0.1mL/kg 生理盐水，持续25d。

1.2 实验仪器及试剂

试剂 香叶木素(YM190207A03)、总超氧化物歧化酶(TSOD)测试盒(南京建成，A001-1)，丙二醇(MDA)测试盒(南京建成，A003-1)，BSA标准品、BCA工作液。

实验仪器 缺氧瓶、灌胃针、离心管、微孔板、组织研磨器、离心机、恒温水浴箱、玻璃棒、水池。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠低张性缺氧实验

三组小鼠最后一次灌胃30min后，每组随机选出5只小鼠分别放进盛有5g钠石灰的广口瓶中。用凡士林涂抹瓶口周围，确保广口瓶的密闭性，随后观察小鼠存活状态，记录小鼠死亡时间(判断标准：胸口不再起伏)，用此来作为小鼠常压耐缺氧时间。

1.3.2 小鼠亚硝酸钠中毒缺氧实验

三组小鼠最后一次灌胃30min后，随机选出5只小鼠，各组小鼠腹腔注射5%亚硝酸钠(0.1mL/10g)，注射后观察小鼠生存情况直至小鼠呼吸停止，记录死亡时间。

1.3.3 急性缺血缺氧实验(断头)

三组小鼠最后一次灌胃30min后，每组随机选出5只小鼠，自颈部断头，记录小鼠断头后出现张口喘息至停止呼吸的时间。

1.3.4 小鼠负重游泳

三组小鼠最后一次灌胃30min后，每组随机选出5只小鼠，将小鼠放入水槽，进行游泳实验，水温(25±2)℃，将自身体重8%铅丝重物绑的位置在尾部1/3-2/3处，且系重物绳子不能接触桶底，在整个实验过程每只小鼠四肢不停运动，用秒表准确记录小鼠力竭游泳时间，小鼠入水至头部全部入水持续 8S内不能浮出水面为止表示为力竭游泳时间。

1.3.5 小鼠爬杆实验

三组小鼠最后一次灌胃30min后，每组5只，杆光滑，长100cm、直径7mm，垂直悬挂，将经训练筛选过的小鼠分别放在玻璃棒上端，记录小鼠肌肉疲劳乏力而无法抱住玻璃棒上端最终落下的时间，反复3次。

1.3.6 小鼠肝脏SOD活性和MDA含量测定

小鼠低张性缺氧死亡后迅速解剖并制备肝脏匀浆。方法为取出小鼠肝脏，称重0.2g，用移液管盛入9倍的0.9%的Nacl溶液，将剪碎的肝脏组织放入到离心管中，用研磨枪充分研磨直至成匀浆，浓度为10%，匀浆离心10min (3000r/min)，取上清液分装待用。根据SOD试剂盒说明书和MDA试剂盒说明书操作和计算[6]。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度香叶木素对小鼠低张性缺氧模型的影响

结果如表1，给予小鼠香叶木素灌胃25天后，与NOR相比较，香叶木素低剂量小鼠存活时间由(7.34±0.21) min增加(10.78±0.45) min，差异有统计学意义；高剂量组亦明显延长小鼠低张性缺氧存活时间(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表1 香叶木素对小鼠低张性缺氧、亚硝酸钠和急性缺血缺氧的影响(±s，min)

表1 香叶木素对小鼠低张性缺氧、亚硝酸钠和急性缺血缺氧的影响(±s，min)

注：与NOR 比较P<0.05，#P>0.05。

组别 低张性缺氧存活时间 亚硝酸钠中毒性缺氧存活时间 急性缺血缺氧实验NOR 7.34±0.21 24.73±1.64 19.30±0.62低剂量香叶木素组 10.78±0.45* 25.02± 2.37# 26.72+3.02*高剂量香叶木素组 12.04±1.03* 30.35± 2.51* 30.42+2.28*

2.2 不同浓度香叶木素对小鼠亚硝酸钠中毒性缺氧的影响

与正常组比较，香叶木素低剂量组能延长小鼠亚硝酸中毒缺氧耐受的时间，但不具有统计学意义，高剂量组能延长存活时间，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

2.3 香叶木素对小鼠急性缺血缺氧的影响

结果见表1，高、低剂量香叶木素组小鼠急性缺血缺氧存活时间与NOR组相比显著增加，小鼠断头后张口呼吸时间明显延长(P<0.05)，说明香叶木素能提高小鼠急性缺血缺氧的存活时间。

2.4 不同浓度香叶木素对小鼠负重游泳的影响

给予小鼠灌胃香叶木素 25天后，高，低剂量香叶木素两组小鼠负重游泳时间与NOR组明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见表2，低剂量香叶木素组小鼠负重游泳时间由(96.4±13.50) s增加至(328.25±18.03) s，提高率为70.63%；高剂量香叶木素组负重游泳时间(96.4±13.50) s增加至(423.65±30.26) s，提高率为77.24%。

2.5 不同浓度香叶木素对小鼠爬杆实验的影响

给予小鼠灌胃香叶木素 25天后(结果见表2)，与正常组比较，低剂量香叶木素组爬杆时间明显延长，由(74±8.48) s增加到(102.52±12.05) s，P<0.05；高剂量组增加到(386.16±24.22) s，P<0.01，差异有统计学意义。

表2 香叶木素对小鼠爬杆实验和负重游泳实验的影响(±s，s)

表2 香叶木素对小鼠爬杆实验和负重游泳实验的影响(±s，s)

注：*与NOR 比较P<0.05，※P<0.01。

组别 爬杆时间 游泳时间NOR 74±8.48 96.4±13.50低剂量香叶木素组 102.52±12.05* 328.25±18.03※高剂量香叶木素组 386.16±24.22※ 423.65±30.26※

2.6 不同浓度香叶木素对各组小鼠肝组织匀浆中MDA含量和 SOD活性的影响

如表3所示高、低剂量香叶木素组小鼠肝脏匀浆MDA含量明显减少，NOR组小鼠肝脏中的MDA含量高于高、低剂量香叶木素组(P<0.05)，差异有统计学意义。与NOR组小鼠肝脏的SOD活性相比，高、低浓度香叶木素组明显降低，统计学有意义P<0.05。

表3 不同浓度香叶木素对小鼠肝脏SOD活性、MDA的影响(±s)

表3 不同浓度香叶木素对小鼠肝脏SOD活性、MDA的影响(±s)

注：SOD:超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛，*P<0.05, 与NOR比较。

组别 例数SOD活性(μ/mL) MDA(nmol/L)NOR 5 156.21±10.06 5.92±1.26低剂量香叶木素组 5 202.53±18.12* 3.36±0.06*高剂量香叶木素组 5 265.04±20.03* 2.92±0.08*

3 讨论

缺氧是因组织氧气供应不足或者利用氧气出现障碍而产生组织代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程，严重缺氧会引起心和脑等重要器官的不可逆的损伤，最终导致机体死亡[7]。本实验采用低张性缺氧、亚硝酸钠中毒性缺氧以及急性脑缺氧实验模型观察香叶木素对缺氧耐受的影响，低张性缺氧为非特异性缺氧，亚硝酸钠中毒属于组织细胞外液缺氧，亚硝酸钠可使血红蛋白中二价铁氧化为三价铁，变成高铁血红蛋白，从而失去携带氧气的能力，引起组织细胞缺氧。在急性脑缺血缺氧试验中，由于脑组织缺乏血液供应，呼吸只能利用自身存储氧气短暂维持，从而表现为张嘴喘气。本试验结果显示，与NOR组比较，香叶木素低剂量组和高剂量组可以明显延长低张性缺氧、亚硝酸钠中毒性缺氧以及急性缺氧条件下小鼠存活时间，具有统计学意义，说明其对心脏和脑缺氧具有改善作用，并提高心脑组织对缺氧的耐受。

疲劳是机体由于长时间或过于繁重的脑力和体力劳动而引起的工作效率暂时降低的一种生理心理现象[8]，运动性疲劳是由机体一系列生化改变导致的肌肉收缩力降低而产生的，是最直接和最客观的机体运动耐力的降低表现[]，力竭游泳和爬杆时间一直以来被作为反映运动性疲劳的重要指标。本实验结果显示香叶木素组小鼠负重游泳时间明显延长(P<0.05)；香叶木素组爬杆时间明显延长(P<0.05)，实验结果说明其有显著的抗疲劳作用。

实验证实缺氧可改变机体氧自由基代谢，主要表现为抗氧化能力下降和脂质过氧化反应增强。SOD是机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用清除氧自由基的酶，可以直接反映机体抗氧化水平，与多种疾病的发生和发展关系密切[10]。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其可以间接反映机体抗氧化能力及清除氧化产物的能力[11]。本实验结果显示结果显示香叶木素组提高小鼠肝脏中SOD的活性(P<0.05)，小鼠肝脏MDA含量明显减少(P<0.05)，结果显示香叶木素能增强肝脏内SOD的活性，降低MDA含量，从而减轻损伤。

本实验结果说明香叶木素有良好的缺氧耐受和抗疲劳作用，其作用机制与抗氧化有关，本实验为香叶木素的开发和应用提供实验基础。