活化的PPAR-γ对溃疡性结肠炎大鼠Th细胞的调控研究

曹艳 程正位 程思

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是结肠和直肠的慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层[1]，特征是肠道炎症反复和病程长，溃疡性结肠炎发病原因及机制复杂，目前尚不明确，有研究认为该病是由遗传、环境、免疫及精神心理等多种不同因素共同作用的结果，而免疫调节在该病中具有重要作用[2]。溃疡性结肠炎的肠道病变不仅与上皮炎症和坏死有关，也与上皮细胞过度凋亡有关，过氧化物酶体增生物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated receptor-gamma， PPAR-γ）可能参与了溃疡性结肠炎肠道炎症的调控。近年来研究表明UC患者T细胞免疫失衡与其发病机制密切相关[3-4]。PPAR-γ属于核激素受体超家族的亚族，为配体依赖性转录因子，近年发现，PPAR-γ广泛表达于T细胞、B细胞等免疫细胞，参与机体的免疫调节。目前研究表明，PPAR-γ可通过参与调控Th1/Th2细胞分化而发挥免疫调节功能[5-6]。本文旨在研究配体活化的PPAR-γ对溃疡性结肠炎模型大鼠T细胞免疫紊乱的调控作用，为UC的临床治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

实验动物（SD）大鼠60只（购自实验动物中心），重量（200±20）g，酶标仪及IFN-γ、IL-4的ELISA试剂盒购自深圳达科为科技公司，TZD类药物罗格列酮片为葛兰素史克公司出品，4 mg/片；UC的阳性药物柳氮磺吡啶（SASP）为上海三维制药有限公司产品，0.25 g/片；三硝基苯磺酸（TNB）购自Sigma公司。

1.2 溃疡性结肠炎大鼠模型的建立

实验模型建立及分组[7]：取实验动物（SD）大鼠60只，其中50只应用三硝基苯磺酸（TNB）/乙醇方法制备大鼠溃疡性结肠炎模型，实验前禁食24 h，自由饮水，10%（w/v）水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg），将TNB溶于500 ml/L乙醇至终浓度100 g/L，取塑料导管一根，术前石蜡油润滑，从大鼠肛门中插入深度约8 cm，缓慢推注TNB/乙醇溶液，每只大鼠约0.3 ml，推注完毕后缓慢拔出硅胶管，以手压迫肛门并抬高鼠尾。实验设正常对照组（健康小鼠）、模型对照组、SASP处理组（SASP，100 mg/kg）、低剂量罗格列酮组（罗格列酮2 mg/kg）、中剂量罗格列酮组（罗格列酮4 mg/kg）、高剂量罗格列酮组（罗格列酮8 mg/kg），每组10只，SASP处理组每天给予SASP 100 mg/kg混悬液灌胃，不同剂量罗格列酮组分别每天给予罗格列酮2、4、8 mg/kg混悬液灌胃，正常对照组、模型对照组每天给予等体积生理盐水3 ml/只灌胃，每天灌胃给药1次，给药时间从造模后第2天至实验结束共10 d，每日观察大鼠一般状况及粪便性状，记录评分。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 疾病活动指数（DAI） DAI=体重下降分数+粪便性状分数+便血分数。每日记录各组动物体重和大便性状，采用DAI对动物状态进行综合评分[8]。体重：不变为0分，比正常下降1%～5%为1分，下降6%～10%为2分，下降11%～15%为3分，下降15%以上为4分。大便黏稠度：正常为0分，松散的大便为2分，腹泻为4分。大便出血：正常为0分，显性出血为2分。

1.3.2 ELISA法检测各组外周血中IFN-γ、IL-4的水平 在培养的最后1天（第10天）取大鼠尾静脉血，并分离上清，采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-4水平，具体操作按试剂盒提供的说明书进行，每个样本和标准品均设3个复孔，酶标测试仪450 nm处读数，计算Th1型与Th2型细胞因子的比值IFN-γ/IL-4。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析和处理，实验结果以表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组DAI比较

与正常对照组比较，模型对照组与低剂量罗格列酮组DAI更高，差异有统计学意义（P<0.05）；SASP处理组和中、高剂量罗格列酮组与正常对照组DAI比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 各组DAI比较 [分，（±s）]

表1 各组DAI比较 [分，（±s）]

*与正常对照组比较，P<0.05；#与正常对照组比较，P>0.05。

组别 D A I正常对照组（n=1 0） 0.7 5±0.1 7模型对照组（n=1 0） 4.9 1±2.2 5*S A S P处理组（n=1 0） 0.8 4±0.2 1#低剂量罗格列酮组（n=1 0） 3.2 2±1.5 4*中剂量罗格列酮组（n=1 0） 0.8 8±0.2 7#高剂量罗格列酮组（n=1 0） 0.7 1±0.1 5#

2.2 UC大鼠模型经过药物处理前后外周血中细胞因子的变化比较

模型对照组IFN-γ/IL-4高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），SASP处理组IFN-γ/IL-4与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；中、高剂量罗格列酮组IFN-γ/IL-4与正常对照组及SASP处理组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 UC大鼠模型处理组与正常对照组外周血细胞因子的检测（±s）

表2 UC大鼠模型处理组与正常对照组外周血细胞因子的检测（±s）

*与正常对照组比较，P<0.05；#与正常对照组比较，P>0.05。

IFN-γ/IL-4正常对照组（n=10） 13.40±6.22 19.26±5.12 0.70±0.21模型对照组（n=10） 20.42±7.54* 14.02±4.92* 1.46±0.51*SASP 处理组（n=10） 14.50±4.22# 18.20±5.76# 0.79±0.37#低剂量罗格列酮组（n=10） 18.42±6.54* 15.02±5.92* 1.16±0.41*中剂量罗格列酮组（n=10） 14.56±3.28# 19.70±4.16# 0.74±0.32#高剂量罗格列酮组（n=10） 13.56±3.28# 18.90±5.16# 0.73±0.23#组别 IFN-γ（pg/ml）IL-4（pg/ml）

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种病因不明的结肠黏膜和黏膜下炎症性疾病，重者可发生溃疡。目前认为UC是多种因素，如遗传、环境、免疫因素在具有遗传易感性的宿主中通过异常黏膜免疫反应引起的。TNB类药物诱导的结肠炎模型表达Th2型细胞因子，中性粒细胞浸润局限于黏膜浅层，类似于人类UC，已广泛应用于UC发病机制、药物疗效评价等研究。PPAR-γ属于核激素受体超家族的亚族，为配体依赖性转录因子，主要有α、γ和δ/β三种亚型，其在脂代谢、糖代谢和肿瘤细胞的分化和凋亡中起重要作用。近年发现，PPAR-γ广泛表达于T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞，参与机体的免疫调节[9-11]。Th1和Th2细胞都是辅助T细胞，其通过分泌多种细胞因子使人体产生免疫应答[12]。Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ，参与细胞免疫和迟发性超敏性炎症反应；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，其可辅助B细胞分化为抗体分泌细胞，参与体液免疫应答。目前更有研究表明，PPAR-γ可通过参与调控Th1/Th2细胞分化而发挥免疫调节功能。但是活化的PPAR-γ在动物实验中对UC的Th细胞的免疫调节作用尚不明确[13-15]。

在本次实验中，通过构建了UC的大鼠模型，探讨活化的PPAR-γ对UC模型大鼠外周血中Th1/Th2细胞分化相关细胞因子的影响。与正常对照组比较，模型对照组与低剂量罗格列酮组DAI更高，差异有统计学意义（P<0.05），SASP处理组及中、高剂量罗格列酮组与正常对照组DAI比较差异无统计学意义（P>0.05），这为该实验的合理性提供佐证。在经过药物处理前后外周血中细胞因子的变化比较中，模型对照组Th1型与Th2型细胞因子的比值高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），SASP处理组IFN-γ/IL-4与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；中、高剂量罗格列酮组IFN-γ/IL-4与正常对照组、SASP处理组比较差异无统计学意义（P>0.05），提示罗格列酮可通过激活PPAR-γ的活化，参与调控Th1/Th2细胞分化，从而发挥缓解结肠炎症的作用，但具体的机制有待进一步研究。

目前，溃疡性结肠炎的病例日益增多，临床治疗面临困境，常规治疗手段疗效不佳或副作用多。活化的PPAR-γ可调节Th1/Th2细胞分化，且应用合成的PPAR-γ配体（TZD）治疗一些自身免疫性疾病，具有疗效好、副作用小、耗费低等优点，从而有可能成为治疗UC的有效药物。因此本课题为阐明配体活化的PPAR-γ调节UC患者外周血Th1/Th2细胞分化的分子机制，为该药应用于UC的临床治疗提供了实验数据，同时还可为临床上Th1/Th2细胞分化失衡的其他免疫调节失衡性疾病的治疗提供了新靶点和手段[16]。