复发性流产基因缺陷分析及临床意义＊

闵爱萍 罗晓 冯欣 夏秀英 许洪梅 梁琼华

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）美国生殖医学学会的标准是2次或2次以上妊娠失败[1]。在我国通常指与同一配偶连续发生3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失，但大多数专家认为，连续发生2次流产即应重视并予评估，因其再次出现流产的风险与3次者相近[2]。研究表明，遗传缺陷是导致自然流产的主要原因，RSA胚胎染色体异常率高于偶发自然流产。本研究采用高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）检测流产胚胎及绒毛组织染色体DNA拷贝数，有助于寻找可能的遗传学因素和父母双方遗传学背景，对再次妊娠采取有针对性的孕前优生指导提供遗传学依据[3]。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群抽样选取2015年12月-2020年1月在乐山市人民医院自然流产患者流产组织样本105例，排除1例样本不合格，4例放弃检测，有效统计数据100例。纳入标准：（1）流产或引产前B超检查均提示胚胎或胎儿停止发育；（2）孕周<28周。排除标准：（1）已知有家族性基因遗传疾病；（2）计划不再生育；（3）样本不合格；（4）患者及家属放弃检测。其中1次自然流产患者38例，2次自然流产患者49例，≥3次自然流产患者13例。胎儿丢失≥2次诊断为RSA。患者年龄为20～42岁，平均（29.07±4.83）岁，胚胎停育孕周为7+6～27+4周。研究经医院科技委员会（乐市医院科委【2016】11号）和伦理委员会（乐市医院伦委【2016】38号）批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 NGS检测方法

利用NGS技术对流产组织（包括胎儿皮肤组织、绒毛组织）进行染色体数目及结构异常检测。在无菌条件下取流产组织物50～100 mg，用0.9%的无菌生理盐水多次漂洗并固定标本，放入无菌标本瓶中送检。与广州达安临床检测中心合作，在知情同意基础上进行染色体异常检测（NGS），使用广州市达瑞生物技术股份有限公司的核酸提取及纯化试剂盒对样本进行基因组DNA的提取，使用文库构建通用试剂盒进行文库构建，最后使用测序通用试剂盒在高通量测序仪上进行测序，完成对基因组拷贝数的检测。

1.3 观察指标

胚胎染色体NGS检查和父亲双方染色体核型分析。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 22.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流产样本特征

流产事件主要集中在孕早期（<12周），占66%，见表1。

表1 流产样本特征

2.2 不同年龄段染色体异常发生情况比较

将孕期胚胎停育流产组织样本依年龄分为4组，不同年龄段染色体数目和结构异常比较，差异无统计学意义（χ2=2.336，P>0.05），见表2。

表2 不同年龄段染色体异常发生情况比较例

2.3 不同流产次数患者染色体异常发生情况比较

初次流产患者染色体异常发生率较高，但与复发性流产患者比较差异无统计学意义（P>0.05），从数据得出流产次数越多，胚胎染色体异常比例越高，见表3。

表3 不同流产次数患者染色体异常发生情况比较例

2.4 胚胎染色体异常与夫妻染色体异常情况

100例自然流产样本中54例胚胎染色体异常，其中42对夫妻进行了染色体核型检查，6例母亲染色体核型异常，3例丈夫染色体核型异常，1例夫妻双方染色体核型异常，由夫妻染色体异常导致的胚胎染色体异常比例低，仅为18.5%（10/54），见表4。

表4 胚胎染色体异常与夫妻染色体异常情况

2.5 流产组织NGS检测结果

100例染色体送检样本异常染色体54例，其中初次流产患者22例，RSA患者32例。

2.5.1 初次自然流产染色体异常情况 38例初次自然流产患者流产组织染色体数目及结构异常的阳性标本22例，占57.9%（22/38），数目异常21例，结构异常1例，整套染色体单亲二倍体0例，染色体非整倍体率为55.3%（21/38）。常染色体三体10例，以16号（5/21，23.8%）、4号（3/21，14.3%）、22号（2/21，9.5%）染色体高发。性染色体数目异常4例，结构异常1例，常染色体合并性染色体异常2例，嵌合体5例。除1例92，XXXX四倍体外其余均检测出非整倍体，染色体片段≤5 Mb的结构异常发生率占阳性标本比例为4.5%（1/22），其中以染色体结构重复为主，缺失次之，见表5。

表5 22例初次自然流产染色体异常情况

2.5.2 RSA染色体异常情况 62例RSA患者流产组织染色体数目异常及结构异常32例，占51.6%（32/62），阴性标本占48.4%（30/62）。数目异常31例，结构异常1例，整套染色体单亲二倍体0例，染色体非整倍体率为51.6%（32/62），常染色体三体22例，13-三体并21-三体并22-三体1例，8-单体并22-三体1例，1-单体并3-三体1例，性染色体数目异常2例，三倍体5例，未检测出嵌合体。以16号（5/32，15.6%）、X 号（5/32，15.6%）、22号（3/32，9.4%）、13号（3/32，9.4%）染色体高发，其中69，XXX三倍体1例，无染色体数目异常，仅有结构异常，也以染色体结构重复为主，缺失次之，见表6。

表6 32例RSA染色体异常情况

2.6 拷贝数异常（CNV）与致病性情况

检索ClinGen、Decipher数据库（染色体变异已知综合征和病例数据库）、OMIM数据库（遗传病、性状和基因的数据库）、DGV数据库（正常人染色体拷贝数数据库）。共检出微重复（<10 Mb）9例，占16.67%（9/54）。38例初次自然流产样本22例CNV，致病CNV 28个；62例复发性样本32例CNV，致病CNV 37个。

3 讨论

随着现代社会压力增高，环境污染不断恶化等因素导致RSA的发生呈逐年上升趋势。目前认为胎儿染色体发生异常的常见影响因素有两个，一是年龄，二是家族史[4]。大部分胚胎染色体异常是由于生殖细胞受到内外界环境影响导致染色体不分离或突变引起的[5]，可发生在染色体正常的夫妇，并不一定是垂直遗传[6]。胚胎死亡和自然流产是胚胎早期发育自然选择的主要途径[7]，临床上自然流产的发生率为15%～25%[1]，且80%以上发生在妊娠12周前[8]，流产发生越早，其胚胎染色体异常的发生率越高[9]，胚胎染色体异常是RSA最常见的原因，占半数以上[10-11]。自然流产染色体异常绝大多数为数目异常占85%～90%，以16、18、21三体和X染色体单体为主[12-13]；染色体结构异常占6%～10%，包括易位、倒位、缺失、重复等；染色体嵌合占8%[14]。目前没有任何一种染色体检测方法是完美无缺的[15]，常规染色体核型分析是诊断早期流产的金标准，但检出率较低[16]，近年来NGS技术用于检测流产组织的非整倍体和拷贝数变异（copy number variation， CNV），还能发现未知改变[17]，被各大医院广泛推崇[18]。虽然该技术有诸多优势，但不能发现染色体平衡易位、倒位或点突变及染色体整倍体[19]，因此笔者认为各种染色体检测方法各有优缺点，应取长补短，为临床精准诊疗提供了新的思路和方法[20-22]。

本研究运用NGS技术对100例自然流产患者的流产组织成功进行了检测，既往研究认为年龄是影响胚胎染色体异常的重要因素，随着年龄的增长，减数分裂过程中纺锤体形成的误差率增加[23]，受精卵中出现染色体异常的分离和复制有关。但本研究结果显示≤30岁自然流产发生率占66%，发生在12周前自然流产发生率也占66%，从数据得出流产次数越多，胚胎染色体异常比例越高。统计对比发现，RSA患者胚胎染色体数目异常率高于初次自然流产患者，但差异无统计学意义（P>0.05）。

本研究三体型与单体型发生率与文献[24-25]报道基本相符，最常见的三倍体主要发生在16、4、22、X、13号染色体上，但RSA患者与初次自然流产患者染色体非整倍体发生略有差异，RSA染色体三倍体发生顺位以16、X、13、22号染色体高发为主，而初次自然流产以16、4、22号染色体高发为主，究其原因不除外样本量少造成的统计差异，但也可能提示染色体三倍体发生位置不同导致的流产再发生率不同。单倍体主要发生在X染色体单体上，RSA患者X染色体三倍体占比较高，与文献[24-25]报道基本相一致。本研究初次自然流产和RSA X染色体单体发生率基本相等，由于单体型染色体异常的原因除减数分裂时性染色体不分离，导致减少一条性染色体外，其中大约75%是父系性染色体丢失，该结果可能提示，由于父系性染色体丢失，X染色体单体发生率越高越易造成自然流产，该方面有待进一步扩大样本量并深入研究。

本研究在组织样本中检测出1号与19号染色体非整倍体异常，既往文献[26]报道未能检测出此2种染色体异常，弥补了该空缺。在染色体异常造成的异常流产性疾病中，主要以染色体结构重复为主，染色体结构缺失次之，与文献报告不一致。由夫妻双方染色体异常导致的胚胎染色体异常比例低，仅为18.5%（10/54）。检索文库得出38例首次自然流产样本致病CNV 28个，62例复发性样本致病CNV 37个。包括16-三体综合征、21-三体综合征、Schmid-Frac-caro氏综合征（Schachenmann氏综合征）、虹膜缺损-肛门闭锁综合征、G三体综合征、猫眼综合征、Tuner综合征、1p36缺失综合征、8q部分单体综合征、Patau综合征、18-三体综合征（爱德华氏综合征）、XXY综合征（克氏综合征、先天性睾丸发育不全）等。NGS技术可覆盖全基因组进行CNV分析，除了可以发现非整倍体改变外，还可发现致病性及可能致病性CNV，可明显提高异常检出率[27]。但仍有一部分染色体拷贝重复或缺失临床意义尚不明确。

本研究采用NGS技术检测出样本微重复（<10 Mb）9例，检索数据库了解相关的致病基因和可能导致的疾病，这在常规染色体核型分析中很难或不能被发现，具有重大临床意义。同时NGS将染色体的诊断水平提高到基因水平，在遗传学分析中表现出明显优势。笔者建议，临床诊疗实际工作中，应重视遗传学病因的筛检，可将NGS技术应用于RSA遗传学病因的研究，为临床实际应用提供科学依据。当然，RSA病因探寻除遗传学因素外，还包括染色体多态性[28]、内分泌、免疫、解剖、血浆高凝状态及环境、生活方式等因素[29]，应综合全面评估，才有利于指导再次妊娠[30]。