顶空-气相色谱法测定反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸含量

王俊红，高歌，张圆圆，单颖，董伟仁

（浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

挥发性脂肪酸（volatile fatty acids,VFA）也被称为短链脂肪酸，是碳水化合物在反刍动物瘤胃内经多种微生物发酵后产生的主要产物。反刍动物体内的VFA 主要为乙酸、丙酸、丁酸，占VFA 总量的90%～95%[1]，其所提供的能量约占反刍动物所吸收利用营养物质总能量的2/3[2]。因此，开展VFA的测定对研究反刍动物瘤胃发酵、提高饲料营养吸收和能量转化率具有重要意义。

目前，VFA 的检测方法主要包括气相色谱法[3-5]、高效液相色谱法[6]、原子吸收分光光度法[7]和毛细管电泳法[8]等，其中以气相色谱分析法最为常用。气相色谱法具有可靠性高的优势，但其需要离心、滤膜过滤等复杂的样品前处理过程。另外，复杂的反刍动物瘤胃液成分容易对色谱仪的进样口和色谱柱造成污染，降低分析的准确性，缩短色谱柱的使用寿命，增加维护成本[9]。顶空进样法是利用顶空技术（气体萃取），对复杂基质样品中的短链物质进行分析的方法[10-11]。该方法无需复杂的样品前处理过程，即可用于样品的定性及定量分析，在测定反刍动物瘤胃液VFA时具有独特的优势，避免了非挥发性成分对分析造成的干扰，减少了仪器污染，弥补了气相色谱检测法的缺陷。

本文建立了顶空-气相色谱（headspace-gas chromatograph, HS-GC）检测反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸的分析方法。该方法不需要进行样品前处理，简单快速，重现性好，准确度高，可进行广泛应用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HSS 86.50 顶空进样器（意大利DANI 公司）；GC-2010 Plus气相色谱仪（日本岛津公司），配备氢火焰离子化检测器（flame ionization detector,FID）；Eppendorf 系列移液器；顶空瓶压盖器，购自江苏省南通飞鸿包装有限公司；冰乙酸、丙酸、丁酸均为色谱纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、丙醇、丁醇均为色谱纯，购自北京百灵威科技有限公司；空气、氮气、氢气均购自杭州今工物资有限公司；超纯水由NANO pure UV/UF 超纯水系统生产。

1.2 标准溶液配制

分别称取乙酸、丙酸、丁酸标准品，用纯水定容，配制成320 mmol/L乙酸、32 mmol/L丙酸、32 mmol/L丁酸的混标储备液，备用。分别移取不同体积的标准储备液，配置成不同浓度的混合标准品溶液。

1.3 顶空进样条件

顶空进样器平衡温度85 ℃，样品流路温度180 ℃，传输线温度200 ℃，平衡时间30 min，进样时间1 min。

1.4 气相色谱条件

色谱柱为SH-Stabilwax 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度200 ℃，载气为氮气（99.999%），载气压力100 kPa，分流比50∶1。升温程序：80 ℃保持1 min，以8 ℃/min 升温至170 ℃，20 ℃/min 升温至220 ℃，保持4 min；FID 温度220 ℃。

1.5 样品处理

检测样品包括奶牛和湖羊的天然瘤胃液和人工瘤胃发酵液。分别准确量取1 mL 样品于20 mL顶空瓶中，用硅胶隔垫密封，铝盖封口，混合均匀后置于自动顶空进样器中，在一定温度条件下平衡预热一段时间后，取平衡气体进行测定。

2 结果与分析

2.1 平衡温度

为确定最佳的平衡温度，本实验选取60、65、70、75、80和85 ℃这6个温度进行HS-GC分析。结果发现，随着温度的升高，VFA 各组分峰面积响应值随之变大，在85 ℃时样品出峰达到最大值（图1）。随着温度的进一步升高，水蒸气含量增大，顶空瓶的蒸气压力随之加大，顶空瓶的承压加大并存在安全隐患问题，同时，蒸气压的增大亦会导致顶空瓶的气密性变差，影响数据的重复性。因此，本研究最终选取的顶空平衡温度为85 ℃。

图1 平衡温度与响应信号强度的关系Fig.1 Relationship between balance temperature and response signal intensity

2.2 平衡时间

比较平衡时间分别为20、25、30、35、40 和45 min的响应信号强度，发现随着平衡时间的延长，峰面积响应值变大，在30 min 时峰面积达到最大值（图2）。随着平衡时间的进一步延长，样品的峰面积减小，同时，数据的重复性变差且相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）＞5%。基于数据的稳定性，兼顾时间效率和峰面积，本研究最终选取30 min为最佳进样时间。

图2 平衡时间与响应信号强度的关系Fig.2 Relationship between balance time and response signal strength intensity

2.3 线性范围和检出限（limit of detection,LOD）

取梯度稀释的混标溶液进行HS-GC 测定，得到了乙酸、丙酸、丁酸的线性回归方程，并以信噪比S/N≥3 分析3 种挥发酸的检出限。由表1 可见：乙酸、丙酸、丁酸在相应的浓度范围内，回归方程决定系数（R2）均大于或等于0.999 7，表示在该方法的浓度范围内，挥发性脂肪酸标准曲线的线性关系良好；由信噪比法计算所得的检出限分别为0.329、0.087、0.036 mmol/L，检出限较低，说明该方法可用于反刍动物瘤胃液VFA含量的测定。

表1 挥发性脂肪酸的保留时间、线性范围、线性回归方程及检出限Table 1 Retention time,linear range,linear regression equation,and LOD of the volatile fatty acids

2.4 精密度考察

2.4.1 日内精密度

在同一天内，取同一批样品每隔2 h 测定一次，每天连续测定6 次，计算日内精密度。结果（表2）显示，3 种挥发性脂肪酸峰面积的相对标准偏差（RSD）均不大于3.3%，说明该方法的精密度良好。

表2 日内精密度Table 2 Within-day precision

2.4.2 日间精密度

取同一样品在4 ℃条件下存放，连续测定3 d，考察样品的日间精密度。结果发现，3 d 内挥发性脂肪酸峰面积的日间精密度良好，RSD 范围为0.333%～2.303%（表3）。

表3 日间精密度Table 3 Between-day precision

2.4.3 稳定性

将已知浓度的标准品溶液存放于4 ℃条件下，连续3 d 取样进行HS-GC 分析，考察标准溶液在存放3 d内的稳定性。由表4可知，混合标准品峰面积的RSD 均在8.318%以下，说明在该条件下挥发性脂肪酸在3 d 内有很好的稳定性，测试样品可在3 d内用于检测。

表4 标准品的稳定性Table 4 Stability of the standards

2.4.4 加标回收率

取晨饲前空腹的湖羊瘤胃液样品，测定其中的挥发性脂肪酸浓度后，分别向其中加入低、中、高3个不同浓度的混标溶液，浓度分别为样品测定浓度的80%、100%和120%，按照下式计算加标回收率。

加标回收率=（加标试样测定值－初始量）/加标量×100%.

如表5 所示，乙酸和丁酸的加标回收率范围分别为94.090%～108.130% 和93.540%～100.350%。表明该方法适用于反刍动物瘤胃液中乙酸和丁酸的定量测定。

表5 样品的加标回收率Table 5 Spike recovery rate of samples

2.5 专属性实验

反刍动物瘤胃液中可能含有其他有机化合物，为考察方法的专属性，取可能存在的乙醇、丙醇、丁醇与乙酸、丙酸、丁酸按一定量混合，配成混合溶液，在选定的色谱条件下测定，结果如图3所示。从中可知，3 种挥发性脂肪酸与乙醇、丙醇、丁醇等组分分离良好，这些有机化合物的存在不会干扰乙酸、丙酸和丁酸的检出。

图3 挥发性脂肪酸与其他有机溶剂的色谱图Fig.3 Chromatograms of the volatile fatty acids and other organic solvents

2.6 样品测定

取奶牛瘤胃液、湖羊瘤胃液以及人工瘤胃发酵液各3 份，测定挥发性脂肪酸的含量，发现奶牛、湖羊瘤胃液以及人工瘤胃发酵液因物种的不同以及进食精粗饲料的比例不同，其挥发性脂肪酸含量也各不相同。测得的3 种样品中乙酸、丙酸、丁酸浓度相对标准偏差（RSD）范围为0.127%～3.333%（表6）。

表6 3种反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸的含量Table 6 Volatile fatty acid contents in three rumen fluids of ruminants

3 讨论

VFA 是饲料在反刍动物瘤胃内经微生物发酵后产生的主要营养物质，开展反刍动物瘤胃液中VFA的测定对研究肠道微生物与饲料发酵、营养吸收和能量转化率均具有重要意义。在检测过程中，VFA易挥发的特性常导致样品定量不准确、重复性差，同时，瘤胃液中的复杂成分亦影响VFA 色谱峰形及基线的稳定性。

现有的VFA测定方法中，实验样品大都需要经过复杂的前处理操作后方能进样分析。刘立成等[12]采用过滤、离心的方式处理羊瘤胃液，并采用气相色谱外标法测定VFA的含量，结果显示线性方程决定系数均未能大于0.999，推测可能是由于样品在过滤、离心的过程中造成了VFA的损失。戴晨伟等[13]使用酸化过滤法预处理样品，并建立毛细管柱气相色谱分析方法测定合成气厌氧发酵液中的VFA，发现样品色谱图在7.5 min后出现基线漂移，推测可能是因为样品中的杂质导致色谱柱或检测器污染。

本研究采用顶空进样方式，不仅简化了样品的前处理步骤，而且能避免VFA 的挥发性损失，提高结果的准确度。本实验检测结果表明，VFA的标准曲线线性关系良好，回归方程决定系数均不小于0.999 7。此外，顶空进样器排除了样品中非挥发性杂质对气相色谱仪的污染和干扰，有利于维持色谱峰形和基线的稳定性。张俊瑜等[14]采用6种不同的方法对瘤胃液中的VFA进行前处理，并通过添加巴豆酸作为内标降低实验误差。除前处理和进样方式不同外，本研究所用的实验仪器和检测方法与之相同或接近，且3种VFA的检出限、回归方程决定系数、日内精密度、日间精密及稳定性等结果均与之相当，表明顶空-气相色谱外标法是一种操作简便且行之有效的瘤胃液VFA检测方法。

4 结论

本研究采用顶空-气相色谱法测定了反刍动物瘤胃液中的VFA含量。该方法无需样品前处理，直接用顶空瓶进样分析，从而最大限度地保留了原始组分，检测结果更接近样品的真实成分。相比于普通进样分析，顶空进样方式有效降低了样品杂质对色谱柱的污染，降低了维护成本，同时节约了样品前处理所用的实验耗材，是一种符合“绿色分析化学”要求的技术手段。