自然发酵牦牛酸奶中乳酸菌的分离鉴定

金鑫燕，闫忠心

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

乳酸菌是一类革兰氏染色呈阳性的杆菌或球菌，不形成芽孢，不运动，过氧化氢酶试验呈阴性，对葡萄糖发酵能产生50%以上乳酸，而且在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性细菌的总称。在形态学上，主要包括乳酸杆菌和乳酸球菌属两个主要类群。乳酸菌在自然界中分布相当广泛，在土壤、植物根系和许多人类食品、动物的饲料，还有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸菌的存在[1]。乳酸菌能促进营养物质的分解和吸收、促进乳糖吸收减少乳糖不耐受、调节体内消化道的正常菌群、维持微生态平衡、使胃肠道健康、增强免疫功能[2-4]。乳酸菌广泛用于乳制品、蔬菜和肉类产品的发酵和防腐中。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸、双乙酰和过氧化氢外，还能产生多种具有抑菌或杀菌生物活性物质，在抑制各种病原菌和食物腐败等方面起重要作用[5，6]。

牦牛乳跟我国高寒牧区牧民生活息息相关。与普通牛乳相比，牦牛乳含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、脂肪、乳糖和矿物质，具有极高的营养价值[7]，其矿物质易被人体吸收和利用[8，9]。同时，传统牦牛酸奶微生物菌群能够产生多种对人身体健康有益的物质如维生素、氨基酸等，弥补了牧民对必须氨基酸、维生素及矿物质摄入的不足，平衡了牧民的饮食结构[10]。牧民沿用传统方法加工牦牛酸奶和牦牛酥油等乳制品，较好地保存当地自然环境中的有益微生物(特别是乳酸菌)[11]。有研究表明，传统牦牛酸奶来源的乳酸菌具有抗氧化作用与清除氧自由基能力[12-14]。因此，发酵牦牛酸奶是乳酸菌的资源宝库，通过分离出牦牛酸奶中的乳酸菌，对其菌种进行分离鉴定，将为牦牛酸奶的商品开发提供研究基础[15-17]。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品采自青海省海北藏族自治州海晏县、黄南藏族自治州泽库县及同仁市3个不同地区当地居民自然发酵的牦牛酸奶。

1.2 试剂及耗材

试验试剂：生理盐水、MRS(Man Rogosa Sharpe broth)培养基、结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液、茚三酮溶液、75%酒精、蒸馏水。

试验耗材：无菌均质袋、无菌试管、微量移液器及配套吸头、无菌锥形瓶等。

1.3 实验方法

1.3.1样品的采集

将采集好的牦牛酸奶移至于无菌的密封袋内封口，标记采集地名称、序号、奶源等信息后迅速放入装有冰袋的冰盒内。随时更换冰袋，将牦牛酸奶保持在低温的环境下带回实验室，进行乳酸菌的分离培养。

1.3.2乳酸菌的分离纯化及鉴定

1.3.2.1准备工作 将样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后，分别吸取0.1mL倾注于MRS琼脂培养基上，用涂布棒在MRS琼脂平板进行表面涂布，每个稀释度做两个平皿。然后放入36℃±1℃恒温厌氧环境中培养72±2h。

1.3.2.2乳酸菌的纯培养 准备工作：取出第一次培养的平板，观察菌落是否形成后，使用接种环挑取有透明环的、大小、形状、颜色不同的单个菌落，分区划线在灭菌MRS琼脂培养基上，36℃±1℃厌氧条件下培养48h，进一步纯化菌株。待平板上菌落形成后，在光线充足的地方观察平板中的菌落是否为单一、相同的菌落，如有不同菌落，继续分离纯化。直到培养基表面生长的全部为单一、相同的菌落时，对菌株进行编号，并记录颜色、大小、表面突起程度等特征。

1.3.2.3乳酸菌的形态学鉴定 用接种环挑取适量生长良好的分离株菌落，涂片、固定于载玻片上，放置待冷后进行革兰氏染色。在显微镜下仔细观察和记录细胞染色情况、细胞形态和分散情况。在镜检观察时紫色或蓝紫色呈阳性反应，红色为阴性反应。

1.3.2.4乳酸菌的生化鉴定 利用生化鉴定试剂盒(蔗糖发酵管、纤维二糖发酵管、麦芽糖发酵管、甘露醇发酵管、水杨苷发酵管、山梨醇发酵管、乳糖发酵管、七叶苷发酵管、棉子糖发酵管、1%马尿酸钠发酵管)对从中分离到的乳酸菌进行菌种的鉴定。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌分离鉴定结果

2.1.1乳酸菌菌落形态特征

从三个地区不同样品中分离出10株乳酸菌。培养基的菌落形态主要呈现出表面光滑，中部稍微凸起或平坦、边缘整齐的白色菌落，以及菌落中间凸起或平坦、具有粗糙的表面，以及具有边缘不整齐的乳白色菌落。各菌株的具体形态见图1-图3，特征见表1。

图 1 海晏县牦牛乳奶乳酸菌形态特征

图 2 同仁县牦牛酸奶乳酸菌形态特征图

图3 泽库县牦牛酸奶乳酸菌形态特征图

表1 乳酸菌的形态特征

2.1.2乳酸菌镜检结果

乳酸杆菌部分弯曲，分布不规则。乳酸链球菌排列成圆形簇状。

从镜检结果图4来看，1为杆状，2、3、4均为链球状。

图4 海晏县牦牛酸奶中乳酸菌镜检结果

从镜检结果图5来看，1、3、4均为杆状，2为链球状。

图5 同仁市牦牛酸奶中乳酸菌镜检结果

从镜检结果图6来看，1、2均为链球状。

图6 泽库县牦牛酸奶中乳酸菌镜检结果

2.1.3乳酸菌生化鉴定结果

生化鉴定管在37℃下培养24h以后结果如表2所示。

表2 发酵管生化鉴定

经过生化鉴定发酵管试验，结合各乳酸菌镜检结果图得出表2，从三个地区不同样品中分离出10株乳酸菌。其中4株为杆菌分离株和6株球菌分离株。海晏县样品菌种有干酪乳杆菌干酪亚种L.caseisubsp.casei和嗜热链球菌S.thermophilus，同仁市样品中的菌种有嗜酸乳杆菌L.acidophilus、嗜热链球菌S.thermophilus和罗伊氏乳杆菌L.reuieri，泽库县样品中的菌种为嗜热链球菌S.thermophilus。

3 讨论

3.1 其他动物酸奶制品中乳酸菌群组成分析

孟和毕力格等从内蒙古采集的10份双峰驼酸奶和1份新鲜驼奶中分离得出30株乳酸菌，分别归属于乳杆菌属，乳球菌属，肠球菌属和明串珠菌属等14种：德氏乳杆菌乳亚种、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、干酪乳杆菌假植物亚种、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌、香肠乳杆菌和嗜酸乳杆菌群的菌株；乳酸球菌乳亚种、粪肠球菌、鸟肠球菌和坚强肠球菌；肠膜明串珠菌葡聚糖亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种。其中杆菌16株，球菌14株[18]。贾旭等从内蒙古采集了35份山羊奶及奶制品样品分离出31株乳酸菌。并表明在新鲜山羊奶、山羊酸奶和稀奶油中均能分离得到乳酸菌，这些菌分别归属于乳杆菌属、肠球菌属和乳球菌属3个属8个种，乳酸杆菌为20株，乳酸球菌为11株[19]。该地区乳酸杆菌比乳酸球菌丰富，这是分离菌株在温差较大的环境中长期适应的结果。由于季节变化和包内生活做饭加热导致包装内温度变化特别大，从而导致了从内蒙古牧区分离到的乳酸杆菌具有了生长温度范围广的特点。

3.2 青海地区牦牛酸奶样品中乳酸菌群组成分析

罗毅皓等从青海大通、刚察、共和、玉树地区的牦牛酸奶样品和酥油样品中分离出来的乳酸菌，分别是嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、菌种为干酪乳杆菌干酪亚种或鼠李糖乳杆菌。牦牛酸奶样品的主要优势菌是乳酸杆菌和链球菌，除玉树样品中唾液链球菌嗜热亚种较多外，而其他3个地方牦牛酸奶样品都是乳酸杆菌为优势菌，有少量唾液链球菌嗜热亚种和极少量其他种菌类[20]。本试验从青海海晏、同仁和泽库3个不同地区采集到的牦牛酸奶样品中分离到4株乳杆菌和6株乳酸球菌。海晏和同仁样品中乳酸球菌是优势菌，同仁市样品中乳酸杆菌为优势菌。

3.3 影响牦牛酸奶中微生物种类和数量的环境因素

自然发酵牦牛酸奶中微生物的种类和数量与其生存和分离环境密切相关。地理、地形、气候等自然环境因地区而异，少数民族牧民在生产牦牛酸奶时使用的方法也不同，如发酵温度、发酵时间、制作方法、牧民生活习惯、挤奶器具和发酵容器等。这使不同地区不同自然发酵牦牛酸奶制品中分离的乳酸菌种类及优势菌群存在一定差异。

4 结论

从海晏、泽库、同仁三个地区牦牛酸奶样品中分离出10株乳酸菌。其中4株为杆菌分离株和6株球菌分离株。海晏县样品菌种有干酪乳杆菌干酪亚种L.caseisubsp.casei和嗜热链球菌S.thermophilus，同仁市样品中的菌种有嗜酸乳杆菌L.acidophilus、嗜热链球菌S.thermophilus和罗伊氏乳杆菌L.reuieri，泽库县样品中的菌种为嗜热链球菌S.thermophilus。研究结果为青海地区牦牛乳酸菌资源数据库的丰富提供了依据。