银椴苷通过调控miR-218/NEDD9轴影响肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡*

吴雄健，朱海燕，黄利兴，邹玲婷

赣南医学院第一附属医院消化内科，赣州 341000

肝癌是具有较高发病率和死亡率的消化系统恶性肿瘤，约75%～85%为肝细胞癌[1]。手术切除是肝癌的首选治疗方法，然而由于身体状况不佳、严重血管侵犯等原因，仅有不到30%的肝癌患者有机会接受手术。对于大多数肝癌患者，由于无法切除肿瘤，需要采用经动脉化疗栓塞、射频消融等局部治疗手段，然而这些方法疗效有限且常常引发多种并发症[2]。近年来，从天然草药中提取的抗癌药物引起了肿瘤研究者的注意。银椴苷是一种黄酮糖苷类化合物，具有抗炎、抗高血压、抗高血糖、抗高血脂、抗氧化和保肝等多种生物活性[3-5]。此外，银椴苷对人宫颈癌细胞、肺腺癌细胞、肝癌细胞和胃癌细胞具有较强的增殖抑制作用，还可诱导宫颈癌细胞凋亡[6]。miR-218是一种抑癌基因，已有研究发现miR-218低表达与肝癌的恶性临床病理特征相关，过表达miR-218抑制肝癌细胞活力[7]。神经元细胞表达发育下调基因9(NEDD9)是一种局灶性粘附支架蛋白，NEDD9高表达与临床样本中肝癌肿瘤大小、分级、转移、肝内静脉侵犯有关[8]。生物信息学分析显示miR-218和NEDD9存在潜在的相互作用，但miR-218是否靶向NEDD9调控肝癌进展尚不清楚。因此，本研究通过观察不同浓度银椴苷对肝癌细胞生物学行为以及miR-218、NEDD9表达的影响，初步探讨银椴苷调控肝癌细胞生物学行为的分子机制，为银椴苷用于肝癌的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肝癌细胞Huh7购于武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养液和胎牛血清购于美国Gibco公司；银椴苷(CAS号为20316-62-5，纯度≥98%)购于上海源叶生物公司；miR-218抑制物(anti-miR-218)、miR-218模拟物(miR-218 mimics)、抑制物对照(anti-miR-con)、模拟物对照(miR-con)、荧光素酶报告基因载体均由上海吉玛公司提供；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司；Transwell小室和基质胶购于美国Corning公司；膜联蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒购于上海碧云天公司；兔源NEDD9抗体购于上海康朗生物科技有限公司；山羊抗兔二抗购于北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、分组和处理 肝癌细胞系Huh7接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。采用不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L)的银椴苷处理对数期Huh7细胞48 h，依次标记为空白组、银椴苷0.1 mmol/L组、银椴苷0.2 mmol/L组、银椴苷0.4 mmol/L组、银椴苷0.8 mmol/L组、银椴苷1.6 mmol/L组，检测细胞活力、迁移侵袭能力和凋亡率的变化，确定后续实验药物浓度。为验证银椴苷是否通过调控miR-218表达进而影响肝癌细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡，将anti-miR-218、anti-miR-con分别转染至Huh7细胞，0.8 mmol/L的银椴苷处理48 h，依次标记为银椴苷+anti-miR-con组、银椴苷+anti-miR-218组，检测Huh7细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡变化。

1.2.2 MTT法检测细胞活力 将转染Huh7或未转染细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板，根据实验分组加入对应浓度的银椴苷处理细胞。于48 h时向各孔加入20 μL的MTT试剂，继续避光于37 ℃孵育4 h，小心吸取上清，加入150 μL的DMSO，振荡10 min，使结晶溶解。酶标仪分析490 nm处吸光度值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 采用适量结合缓冲液重悬各组细胞，调整为1×106/mL的单细胞悬液。向100 μL细胞悬液中依次加入5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和5 μL的PI，室温避光条件下孵育15 min，补加结合缓冲液使总体积达到500 μL。混匀后，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力将Transwell小室放入24孔板，在小室内铺上用PBS 1∶8稀释的Matrigel(50 mg/L)基质胶。用无血清培养液重悬各组细胞，取300 μL细胞悬液(细胞数约1×105个)添加到小室内，下室加入含20%血清的细胞培养液，培养箱孵育24 h，4%的多聚甲醛固定小室底部膜表面细胞10 min，0.1%的结晶紫染色5 min。PBS洗涤，晾干后，将Transwell小室倒置于显微镜下拍照，随机观察3个视野中细胞数，以均值表示细胞侵袭数目。迁移实验时选择未包被基质胶的Transwell小室，其他步骤与侵袭实验一致。

1.2.5 qRT-PCR检测miR-218和NEDD9 mRNA的表达水平 收集按照1.2.1实验分组进行处理的各组细胞，TRIzol试剂提取RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。按照TaKaRa试剂盒说明书合成cDNA，PCR扩增反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s、60℃ 30～60 s，循环40次进行PCR反应。分别以U6和β-actin为内参，运用2-ΔΔCt法进行分析。

1.2.6 Western blot检测NEDD9蛋白的表达 各组细胞进行相应处理后去除细胞培养液，加入4 ℃预冷的细胞裂解液，冰上裂解30 min后，BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度。制备分离胶和浓缩胶，每孔上样30 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜，加入NEDD9抗体(1∶1000)后，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，用相应的二抗(1∶2000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，用增强型化学发光试剂盒显色。以β-actin为内参，图像处理软件Image J分析目的条带灰度值。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 采用Targetscan数据库进行靶基因预测，显示NEDD9与miR-218存在潜在结合位点，用双荧光素酶报告基因实验验证miR-218和NEDD9的靶向关系。构建含有miR-218结合位点的NEDD9野生型(WT-NEDD9)和突变型(MUT-NEDD9)荧光素酶报告载体，将WT-NEDD9、MUT-NEDD9分别与miR-con、miR-218 mimics共转染至Huh7细胞，转染48 h，检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度银椴苷对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

见图1，不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L)的银椴苷处理肝癌Huh7细胞48 h，MTT实验和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡显示，与空白组比较，银椴苷0.1 mmol/L组细胞的活力[(93.56±8.15)%vs.(100.00±9.72)%，P>0.05]、凋亡率[(4.51±0.55)%vs.(3.46±0.42)%，P>0.05]无显著变化，而银椴苷0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L组Huh7细胞的活力[(82.67±7.47)%，(68.50±7.81)%，(53.33±6.58)%，(41.17±5.37)%vs.(100.00±9.72)%，均P<0.05]显著降低，细胞凋亡率[(10.25±1.26)%，(16.97±2.62)%，(21.02±2.48)%，(28.95±2.59)%vs.(3.46±0.42)%，均P<0.05]显著升高，且具有剂量依赖性。

图1 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡Fig.1 Apoptosis of liver cancer cells detected by flow cytometry

2.2 银椴苷对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

见图2，采用中等浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)银椴苷处理Huh7细胞48 h，Transwell法检测迁移和侵袭数量，结果显示，与空白组比较，银椴苷0.2、0.4、0.8 mmol/L组Huh7细胞迁移数[(165.50±14.84)个，(91.32±10.49)个，(67.17±8.28)个vs.(234.49±24.46)个，F=207.623，P<0.05]和侵袭数[(78.45±8.53)个，(51.02±7.83)个，(26.95±4.38)个vs.(125.85±11.53)个，F=225.841，P<0.05]显著降低，且呈剂量依赖性。

2.3 银椴苷对肝癌细胞miR-218和NEDD9表达的影响

见表1，采用中等浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)银椴苷处理Huh7细胞48 h，qRT-PCR和Western blot检测Huh7细胞中miR-218和NEDD9的表达水平显示，银椴苷处理组miR-218表达水平显著高于空白组(均P<0.05)，NEDD9表达水平显著低于空白组(均P<0.05)，呈剂量依赖性。后续实验中选择0.8 mmol/L银椴苷进行研究。

与空白组比较，*P<0.05；与银椴苷0.2 mmol/L组比较，#P<0.05；与银椴苷0.4 mmol/L组比较，△P<0.05图2 银椴苷对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.2 Effect of tiliroside on the migration and invasion of liver cancer cells

表1 银椴苷影响肝癌细胞miR-218和NEDD9表达Table 1 Effect of tiliroside on the expression of miR-218 and NEDD9 in liver cancer

2.4 miR-218靶向调控NEDD9表达

Targetscan预测到NEDD9的3′-UTR区域含有与miR-218特异结合序列，见图3A。

双荧光素酶报告实验显示，miR-218 mimics和WT-NEDD9共转染组Huh7细胞荧光素酶活性与miR-con和WT-NEDD9共转染组比较显著降低[(0.62±0.08)vs.(1.00±0.09)，t=9.467，P<0.05]；miR-218 mimics和MUT-NEDD9共转染组Huh7细胞荧光素酶活性与miR-con和MUT-NEDD9共转染组比较变化不显著[(1.29±0.12)vs.(1.25±0.13)，t=0.678，P>0.05]。Western blot检测显示，miR-218组Huh7细胞NEDD9蛋白表达水平显著低于miR-con组[(0.25±0.04)vs.(0.64±0.07)，P<0.05]；anti-miR-218组Huh7细胞NEDD9蛋白表达水平显著高于anti-miR-con组[(0.83±0.09)vs.(0.53±0.05)，P<0.05]，见图3B。

2.5 干扰miR-218逆转银椴苷对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

见图4和表2，采用0.8 mmol/L银椴苷处理Huh7细胞48 h，结果显示，与空白组比较，银椴苷处理组Huh7细胞miR-218表达水平、凋亡率显著升高(均P<0.05)，细胞活力、迁移和侵袭数显著降低(均P<0.05)；与银椴苷+anti-miR-con组比较，银椴苷+anti-miR-218组Huh7细胞miR-218表达水平、凋亡率显著降低(均P<0.05)，细胞活力、迁移和侵袭数显著升高(均P<0.05)。

A：miR-218与NEDD9互补的核苷酸序列；B：Western blot检测干扰miR-218后NEDD9的蛋白表达；1：miR-con；2：miR-218；3：anti-miR-con；4：anti-miR-218；与miR-con组比较，*P<0.05；与anti-miR-con组比较，#P<0.05图3 miR-218调控NEDD9表达Fig.3 miR-218 regulates NEDD9 expression

1：空白组；2：银椴苷；3：银椴苷+anti-miR-con；4：银椴苷+anti-miR-218；A：流式细胞术检测肝癌细胞凋亡；B，C：Transwell检测肝癌细胞迁移和侵袭；与空白组比较，*P<0.05；与银椴苷+anti-miR-con比较，#P<0.05图4干扰miR-218逆转银椴苷对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Fig.4 Interfering with miR-218 reverses the effect of tiliroside on the proliferation，migration，invasion and apoptosis of liver cancer cells

表2 干扰miR-218逆转银椴苷对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Table 2 Interfering with miR-218 reverses the effect of tiliroside on the proliferation，migration，invasion and apoptosis of liver cancer

3 讨论

近年来，肝癌发病率不断上升，转移性复发率和死亡率居高不下，已严重威胁人类健康，给家庭和社会带来严重的经济负担。尽管已有多种治疗方法用于肝癌治疗，但往往具有一定的局限性和副作用。研究显示，中药辅助治疗对提高肝癌患者生存率具有一定的积极作用[9]。目前已发现大量具有抗肿瘤作用的天然产物。

研究表明多种植物来源活性成分通过诱导肝癌细胞凋亡、抑制血管生成、减少迁移侵袭而具有抗肝癌作用[10-12]。据报道，在人胰腺癌细胞中银椴苷可引起G2/M期周期阻滞，抑制胰腺癌细胞增殖[13]。但银椴苷对肝癌细胞恶性行为的影响并不清楚。本研究显示，一定浓度的银椴苷可抑制肝癌Huh7细胞增殖、迁移和侵袭，诱导肝癌细胞凋亡，并呈显著的剂量依赖性，这提示银椴苷对肝癌细胞恶性生物学行为具有抑制作用。

miR-218具有抑癌作用，其表达失调与人类肿瘤进展的多个生物学过程密切相关。肝癌组织和细胞中miR-218表达下调，上调miR-218可诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，减缓肿瘤生长[14]。miR-218还可通过调控其下游靶基因抑制肝癌细胞的转移和EMT进程[15]。NEDD9是一种非催化的crk相关底物(CAS)家族支架蛋白，介导大量致癌蛋白的功能，因其具有协同调控转移信号分子的潜力而备受关注[16]。研究显示NEDD9表达上调与上皮性卵巢癌的进展和不良预后相关[17]。NEDD9高表达促进肾细胞癌和肺癌等恶性肿瘤的侵袭转移[18-19]。NEDD9在肝癌中也呈高表达，沉默NEDD9可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭[20]。本研究显示银椴苷呈剂量依赖性地促进肝癌Huh-7细胞中miR-218表达，抑制NEDD9表达，并通过双荧光素酶报告基因实验验证了二者的相互作用。上调miR-218表达后Huh-7细胞中NEDD9的表达水平显著降低，下调miR-218表达后NEDD9的表达水平显著升高，提示miR-218靶向下调NEDD9参与肝癌进展。过表达miR-218与银椴苷在肝癌中的抗癌效果类似，提示miR-218/NEDD9轴可能介导银椴苷的抗肝癌作用。深入研究显示，干扰miR-218表达可逆转银椴苷对Huh-7细胞恶性生物学行为的影响，这进一步说明银椴苷可能通过调控miR-218/NEDD9分子轴抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，银椴苷能够诱导肝癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移和侵袭，其机制可能与上调miR-218/NEDD9轴相关，这初步揭示了银椴苷抗肝癌的分子机制，为将银椴苷开发为抗肿瘤药物奠定了理论基础。