留兰香不同提取物中香芹酮、柠檬烯的含量及其抑菌活性研究

万红才，罗洪莲，刘晓艳，段萍，徐作刚，安军，曾琦（黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000）

留兰香Mentha spicataL.为唇形科植物，全草入药，夏、秋两季采收，除去杂质，鲜用或阴干；留兰香具有疏风清热、解表和中、里气止痛之功效；用于感冒头痛、胃痛、咳嗽、腹胀、吐泻、痛经、肢麻、跌扑肿痛[1]。同时留兰香被人们作为食品广泛食用，还应用于食品化工不同行业，说明留兰香药用及食用保健的价值均得到广泛认同[2]。留兰香药材中香芹酮、柠檬烯是活性成分也是主要成分，本文拟建立气相色谱法对留兰香药材及其提取物中香芹酮、柠檬烯进行定量分析，并制订合理的限度，严格控制其质量；采用管碟法对留兰香药材提取物的抑菌活性进行探索，采用稀释倍数法[3]测定留兰香不同提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的最低抑菌浓度（MIC），为留兰香药用机制及食用领域的拓展开发提供实验依据，为留兰香药材的临床使用剂量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

气相色谱仪（Aglient 7890B），紫外分光光度计（岛津2600），高压灭菌锅（LMQC-80E），超声波清洗仪（SK250LHC），电子天平（梅特勒托利多AG135，感量：0.01 mg），生化培养箱（SPX-250BⅢ），游标卡尺。

1.2 试药

香芹酮对照品（批号：c11052000，含量：99.0%）、正十一烷对照品（批号：c17896300，含量：99.6%）（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH），柠檬烯对照品（批号：100470-201302，含量：96.0%）、枯草芽孢杆菌[批号：63501，每颗（1.0～2.0）×103cfu]、金黄色葡萄球菌[批号：33301，每颗（1.0～2.0）×103cfu]、藤黄微球菌[批号：28001-8a6-2，每颗（1.0～2.0）×103cfu]、菌株复溶液（批号：181105）（中国食品药品检定研究院）；链霉素（批号：130308-201514，含量：726 U·mg－1）、新霉素（批号：130309-201512，含量：652 U·mg－1）、土霉素（批号：130305-201321，含量：872 U·mg－1）（对照品，中国食品药品检定研究院）；其他试剂均为化学分析纯，无菌室及其他常用微生物测定器皿由药品检验微生物检测室提供。

1.3 样品

留兰香共10批次，经贵州省食品药品检验所李扬教授鉴定，均属于唇形科植物留兰香[4]，样品信息见表1。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

2 方法

2.1 香芹酮、柠檬烯含量测定气相色谱分析[5]

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），检测器氢火焰离子化检测器（FID），载气为高纯氮气≥0.9999，柱流量线速度5 mL·min－1；程序升温条件初始温度50℃，以2℃·min－1升温至115℃，以5℃·min－1升温至150℃，气化室温度250℃，检测室温度280℃，分流比30∶1，尾吹20 mL，空气400 mL，氢气40 mL，进样量1 μL。在上述色谱条件下，样品中柠檬烯、内标物正十一烷、香芹酮成分的分离度、理论板数、拖尾因子、对称性均符合《中国药典》2020年版要求[6]，空白样品无干扰（见图1）。

图1 混合对照品、供试品及内标溶液气相色谱图Fig 1 Gas chromatogram of mixed reference substance，test substance and internal standard solution

2.1.2 内标溶液的制备 取正十一烷对照品适量，精密称定，用正己烷稀释制成0.2 mg·mL－1的溶液作为内标溶液[6]。

2.1.3 对照品溶液的制备 取柠檬烯对照品10.44 mg，置于10 mL量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为柠檬烯对照品储备液；另取香芹酮对照品20.36 mg，置于100 mL量瓶中，加柠檬烯对照品储备液5.00 mL，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.1.4 留兰香样品的制备 留兰香挥发油的制备参照《中国药典》2020年版四部通则2204挥发油测定法，准确称量干燥留兰香药材100 g，加入300 mL蒸馏水，连接至挥发油提取装置，采用常压水蒸气蒸馏法提取，得到淡黄色有特殊香味的油状物作为供试品挥发油[6]；称取经粉碎的留兰香药材50 g，加乙醇400 mL，水浴加热回流提取1 h，滤过，重复提取2次，合并提取液，蒸干得供试品醇提浸膏；称取经粉碎的留兰香药材50 g，加水400 mL，热回流提取1 h，滤过，重复提取2次，合并提取液，蒸干得供试品水提浸膏。精密称取供试品挥发油、供试品醇提取浸膏、供试品水提取浸膏约0.5 g和干燥药材粉末约1.3 g，精密称定，分别置于50 mL量瓶中，加入适量内标溶液超声使溶解，放冷，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得各供试品溶液。

2.1.5 线性关系考察 精密称取20.40 mg香芹酮对照品与10.23 mg柠檬烯对照品置10 mL量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，作为混合对照溶液；分别精密量取混合对照溶液1.00 mL置于10、25、50、100、200 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，得香芹酮0.204、0.0816、0.0408、0.0204、0.0102 mg·mL－1和柠檬烯0.1023、0.0409、0.0205、0.0102、0.0051 mg·mL－1的混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液及“2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，用内标法校正，分别以香芹酮、柠檬烯对照品溶液峰面积与内标溶液峰面积的校正值f（f＝A样/A内）为纵坐标（Y），以香芹酮、柠檬烯对照品质量浓度C（mg·mL－1）为横坐标（X）分别绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表2。

2.1.6 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样6次，结果f（f＝A样/A内）统计值符合《中国药典》2020年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则精密度要求[6]（RSD≤2.0%），见表2。

2.1.7 稳定性试验 分别于0、4、8、12、16、20 h精密吸取编号201701留兰香药材挥发油样品，按“2.1.4”项下方法制备供试品，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见表2，说明各成分在20 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 精密称取编号201701留兰香药材提取挥发油样品6份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液及“2.1.3”项下对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，结果见表2。

表2 香芹酮、柠檬烯方法学考察(n＝6)Tab 2 Methodology for determination of carvone and limonene (n＝6)

2.1.9 回收试验 称取编号201701原药材粉末约0.25 g，置10 mL量瓶中，精密量取混合对照品溶液（取柠檬烯、香芹酮对照品适量，加内标溶液制成每毫升含柠檬烯0.001 947 mg、香芹酮0.045 58 mg的混合对照品溶液）1.00、2.00、3.00 mL制成低、中、高质量浓度供试品溶液（各平行3份），分别用含内标物的正己烷溶解超声30 min，冷却后稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品，按“2.1.1”项下方法测定，计算得香芹酮低、中、高质量浓度的平均回收率在96.2%～97.5%，柠檬烯低、中、高质量浓度的平均回收率在95.9%～99.8%，RSD均小于3%，符合2020年版《中国药典》要求。

2.1.10 香芹酮、柠檬烯含量测定结果 取采集的10个批次留兰香样品，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取“2.1.3”项下对照品溶液和上述供试品溶液1 μL进样测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，结果见表3。

表3 留兰香不同提取方法香芹酮、柠檬烯含量测定(mg·g－1)Tab 3 Determination of carvone and limonene content with different extraction methods of Mentha spicata extract (mg·g－1)

2.2 留兰香药材抑菌活性测定

2.2.1 供试菌悬液制备 取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌分别加菌株复溶液复活，再加2%的蛋白胨稀释液稀释含菌量为106～109 cfu·mL－1的菌悬液作为供试菌悬液[7]。

2.2.2 培养皿制备 取经高压蒸汽灭菌冷却至45℃的琼脂培养基15 mL至无菌培养皿中，加供试菌悬液0.05 mL制成各菌种培养皿，每组平行制备3个。

2.2.3 标准品溶液的制备 精密称取链霉素、新霉素、土霉素标准品适量，分别加灭菌水稀释至约0.002、0.02、0.02 mg·mL－1的标准溶液[6]。

2.2.4 供试品溶液的制备 取“2.1.4”项下201701样品制备的供试品挥发油0.5 g，加灭菌水稀释至1.0 mg·mL－1的溶液，供试品醇提浸膏1.0 g加灭菌水稀释至10.0 mg·mL－1、供试品水提浸膏1.0 g加灭菌水稀释至10.0 mg·mL－1的溶液。

2.2.5 方法 参照《中国药典》2020年版四部通则1201抗生素微生物检定法管碟法测定。取各供试品溶液至枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌培养皿中，每皿4碟，皿中1、3接种供试品溶液，2、4接种标准溶液，于37℃恒温箱培养16 h，测定抑菌圈直径[6]，结果见表4。

表4 供试品及标准溶液抑菌圈直径(mm)Tab 4 Antibacterial circle diameter of test product and standard solution (mm)

2.3 最低抑菌浓度测定

用稀释倍数法测定最低抑菌浓度，取“2.1.4”项下201701样品提取的供试品挥发油0.5 g、醇提浸膏1.0 g及水提浸膏1.0 g，分别加灭菌的2%蛋白胨灭菌稀释液稀释至50 mL为供试品挥发油溶液、供试品醇提浸膏溶液、供试品水提浸膏溶液，分别用微孔滤膜滤过装入无菌试管中备用。取试管38支，每支装9 mL胰酪蛋白培养基溶液，加压灭菌后，冷却备用，用灭菌的2%蛋白胨为稀释液，制备供试品挥发油质量浓度分别约为5、0.5、0.05 mg·mL－1和供试品醇提浸膏、供试品水提浸膏质量浓度分别约为10、1.0、0.01 mg·mL－1的溶液，同法制备0.01 mg·mL－1的罗红霉素对照品溶液，制备阳性对照管（加对照品溶液）与空白管。分别接种各实验菌液0.05 mL，于37℃恒温箱培养18 h后，取出，加5%的甲醛溶液抑制细菌再生长，在600 nm波长处测定吸光度[8]，结果见表5。

表5 培养管吸光度值表Tab 5 Absorbance of culture tubes

3 结果

3.1 香芹酮、柠檬烯气相分析结果

各样品中香芹酮、柠檬烯含量相对稳定，原药材中香芹酮达到0.38%以上、柠檬烯0.02%；挥发油中含量较高，香芹酮达到58.1%、柠檬烯2.7%；醇提浸膏以干燥浸膏计香芹酮18.5%、柠檬烯0.9%；水提浸膏以干燥浸膏计香芹酮12.2%、柠檬烯0.6%；该方法适用于留兰香药材各形态样品中香芹酮、柠檬烯测定。

3.2 抑菌活性与最低抑菌浓度分析结果

参照2020年版《中国药典》抗生素效价测定法及中药生物活性测定指导原则，对留兰香药材提取物进行抑菌活性实验，从表4中数据分析结果可知，该样品在不同菌株培养皿中均产生一定的抑菌效果，各抑菌圈直径与标准溶液一致；其中藤黄微球菌培养基灵敏度高，可作为该药材抑菌效价研究首选，同时对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌产生抑菌活性，说明留兰香药材有广谱抑菌作用，可为临床用药提供依据。用稀释倍数法测定最低抑菌浓度，根据培养后观察菌群生长浊度及表5测定吸光度值（A）分析，留兰香药材各组供试品溶液的浊度及吸光度均不同，根据菌群生长浊度观察及吸光度数据分析，将A≤0.30定为有抑菌作用的样品浓度，得到供试品挥发油的MIC为0.05 mg·mL－1，供试品醇提浸膏和水提浸膏的MIC均为0.1 mg·mL－1。

4 讨论

4.1 色谱条件与样品处理的优化

根据文献对测定留兰香样品中香芹酮、柠檬烯成分的气相色谱条件进行优化，采用超声提取法作为样品前处理方法，耗时短（耗时30 min），操作简便；比较甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等提取溶剂，从色谱图的干扰背景及待测成分回收率结果分析，选择用正己烷为提取溶剂效果最佳；内标法是减少气相色谱进样误差，选正十一烷作内标物，保留时间在被测物香芹酮、柠檬烯之间，并与两成分的分离度符合2020年版《中国药典》要求，并将内标物配制成0.2 mg·mL－1的溶液作为内标溶液，该浓度时色谱峰与待测组分一致，用内标溶液作溶剂，确保对照品与供试品溶液制备过程中内标物含量的稳定，减少分次加入内标物的浓度变化误差[9]。该分析方法系统适用性试验中，柠檬烯、内标物正十一烷、香芹酮成分的分离度、理论板数、拖尾因子、对称性均等参数均符合2020年版《中国药典》要求，优化的分析方法灵敏度高，易普及，可为留兰香药材及成品的质量控制提供参考。

4.2 抑菌活性与抑菌浓度研究意义

根据抑菌圈测定数据及最低抑菌浓度分析，留兰香药材对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌都有一定的抑制作用，结合气相色谱分析数据，提取方法不同各供试品溶液中香芹酮、柠檬烯成分含量不同，但提取方法与抑菌活性无显著关系，进一步证明单一的分析方法控制药材质量存在缺陷，用中药生物活性测定方法综合评价药材质量具有科学性。