表油菜素内酯对重度镉胁迫下辣椒幼苗生理特性及抗逆基因的影响

雷 阳，乔 宁，白 扬，杨玉花

(1.山西农业大学 园艺学院，山西 太原 030031；2.山西农业大学 农业基因与资源研究中心，农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031)

镉(Cd)是植物体内的非必需元素，在土壤中的镉极易被植物吸收，并快速从根部转移至地上部[1]，而植物自身缺乏有效的镉代谢途径，因此，镉元素会在植物体内大量富集，会导致植物生长迟滞、光合作用受阻，甚至出现细胞死亡等严重的生理胁迫[2]。随着我国工业化的持续推进，工业废水、废渣携带有大量的镉离子渗透入土壤中。同时纯度不高的农药和化肥中都有镉离子的残留，无节制的施用均导致了农田土壤中镉含量急剧增加[3]。据统计，我国土壤的镉污染情况极其严重，污染超标率高达7.0%[4]。蔬菜产地一般位于集中处理工业废水、废渣的城市近郊，所以蔬菜镉含量极易超标，蔬菜的正常生长发育面临严重威胁[5]。

油菜素内酯(BR)是植物体内重要的固醇类激素，可调控植物种子萌发、光合作用、生殖生长和逆境响应等途径的基因表达和生理代谢[6]。表油菜素内酯(EBR)是一种人工合成的高活性油菜素内酯类似物，生产中常被用作外源油菜素内酯。目前研究发现，EBR对多种植物逆境胁迫具有缓解效应。Singh等[7]在番茄上的研究表明，EBR可以激活番茄中热休克蛋白MT-sHSP合成路径，从而提高番茄抵御高温胁迫的能力；Thussagunpanit等[8]在水稻上的研究表明，表油菜素内酯可以有效提高高温胁迫下水稻种子的发芽率，增加植物体内光合色素的含量，增强植物的光合作用，减轻高温造成的失绿症状；Li等[9]研究表明，在低温胁迫下，EBR可以通过提高辣椒抗氧化酶的活性来减弱逆境下的生理损害；俞明宏等[10]在番茄以及孙维悦等[11]在龙葵上的研究表明，EBR可显著提高镉胁迫下植物的生物量、光能的捕获与转换能力、抗氧化酶活性，并降低镉的转运系数，有效缓解Cd胁迫对植株幼苗生长的抑制作用。近年来，随着我国镉污染的情况不断恶化，农业科学工作者进行了大量关于缓解植物镉胁迫的研究[12-14]。然而，关于表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒生理影响和基因表达的研究尚未见报道。

本研究针对辣椒生产中出现的镉污染问题，探究了重度镉胁迫下不同浓度EBR对辣椒幼苗各项生理指标和抗逆相关基因的影响，旨在探讨EBR对辣椒逆境响应的调节机制，丰富辣椒抗逆机制的理论认识，以期为辣椒耐重金属栽培提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试辣椒品种为晋椒503(CapsicumannuumL. cv. Jinjiao 503)，由山西农业大学园艺学院辣椒育种团队提供。镉离子供体CdCl2和表油菜素内酯(EBR)均购自山西半天生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发试验 选取均匀无病害的晋椒503辣椒种子，用灭菌水在室温下浸泡4～5 h；然后用75%乙醇冲洗20 s，15%的NaClO冲洗15 min，灭菌水洗涤3次，放入真空干燥箱40 ℃烘干30 min，播种于72孔的穴盘中，于25 ℃(光/暗，12 h/12 h)光照培养箱中培养；培养12 d后，取长势一致的幼苗，分别移栽至对照组(CK处理液为灭菌水)和5个处理组(表1)的营养箱中。在处理12 d后分别取样测定各指标含量，每处理3次重复。

表1 试验处理Tab.1 Experimental treatment

1.2.3 RNA的提取及荧光定量PCR分析 分别提取CK、Cd和Cd+EBR100 这3个处理辣椒幼苗叶片总RNA(Omega RNA提取试剂盒，USA)，采用反转录试剂盒(PrimeScript II cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，Japan)进行反转录。

采用SYBR Premix EX Taq TM试剂盒，在ABI 7500 实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR分析。反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40次循环。引物序列见表2。每个样品重复3次，以beta-tubulin为内参基因，选择24 h的CK处理为参数，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016整理数据和作图；采用SAS 1.2分析数据，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗生物量的影响

由表3可知，与未添加镉的CK相比，添加Cd处理的根长、株高、地上部鲜质量和地下部鲜质量均有显著下降(P<0.05)，降幅分别为19.49%，52.57%，32.76%和31.10%；在镉胁迫下，喷施100 μmol/L表油菜素内酯的处理Cd+EBR100比Cd处理的根长显著升高了21.99%(P<0.05)，株高显著增长了11.53%(P<0.05)，地上部鲜质量显著增长了41.20%(P< 0.05)，地下部鲜质量显著增长了33.33%(P<0.05)。说明喷施表油菜素内酯可有效缓解镉胁迫对辣椒幼苗的毒害、促进辣椒幼苗生物量的增加，其中，Cd+EBR100处理的效果最好。

表3 EBR 对镉胁迫下辣椒幼苗生物量的影响Tab.3 Effect of EBR on biomass of pepper seedlings under cadmium stress

2.2 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗叶片光合色素含量的影响

由表4可知，与CK相比，镉胁迫下处理的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量和叶绿素a/叶绿素b均显著降低(P<0.05)，降幅分别为47.13%，30.84%，49.99%和23.56%。说明重度镉胁迫对辣椒叶片的光合色素具有明显的抑制作用。在镉离子胁迫下，施加EBR浓度为50 μmol/L的处理(Cd+EBR50)与Cd处理相比，辣椒幼苗叶片的叶绿素a含量显著提高了28.01%(P<0.05)，叶绿素b显著提高了32.38%(P<0.05)，类胡萝卜素含量显著提高了50.97%(P<0.05)；施加EBR浓度为100 μmol/L的处理(Cd+EBR100)与Cd处理相比，辣椒幼苗叶片的绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均有显著提高(P<0.05)，增幅分别为50.64%，28.31%和63.60%。说明表油菜素内酯可有效提升辣椒光合色素的含量，从而提升幼苗对镉胁迫的耐受性，其中，Cd+EBR50和Cd+EBR100这2个处理的效果较为明显。

表4 EBR 对镉胁迫下辣椒幼苗光合色素的影响Tab.4 Effect of EBR on photosynthetic pigment of pepper seedlings under cadmium stress

2.3 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由图1可知，与CK相比，镉胁迫下处理Cd的CAT活性、APX活性、POD活性、SOD活性均显著下降(P<0.05)，分别降低了45.94%，34.82%，33.35%和37.88%，说明镉离子对辣椒体内的抗氧化酶活性均有显著的抑制作用；在镉胁迫下，不同浓度的EBR对辣椒叶片中的抗氧化酶活性有明显影响，其中，Cd+EBR100处理的效果最为突出，与Cd处理相比，CAT活性、APX活性、POD活性、SOD活性均显著上升(P<0.05)，分别升高了38.44%，103.68%，38.44%和50.04%。值得注意的是，Cd+EBR100处理的APX活性不仅高于Cd处理，还显著高于CK(P<0.05)，说明100 μmol/L EBR不仅可以抵消镉离子对辣椒叶片中APX活性的影响，还可以大幅提升APX活性。

2.4 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗叶片AsA-GSH循环关键酶活性的影响

由图2可知，与CK相比，Cd处理的GR活性、DHAR活性(以鲜质量计)有显著降低(P<0.05)，降幅分别为27.84%，48.93%；MDHAR活性(以鲜质量计)也有所下降，但差异不显著。在镉胁迫下，EBR50、EBR 100、EBR处理显著降低辣椒叶片GR活性、DHAR活性和MDHAR活性(P<0.05)，其中，Cd+EBR100处理的效果最为突出，比Cd处理GR活性上升了38.04%、DHAR活性上升了70.59%、MDHAR活性上升了35.83%。值得注意的是，经过低浓度的EBR(50，100，200 μmol/L)处理的辣椒叶片，MDHAR活性不仅高于Cd处理，同时也高于CK，其中Cd+EBR100处理差异显著(P<0.05)。

2.5 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗叶片AsA-GSH循环的影响

由图3可知，镉胁迫处理(Cd)比CK在GSH、DHA、GSSG含量(以鲜质量计)上有显著升高(P<0.05)，增幅分别为21.79%，59.49%，72.47%；而Cd处理的AsA含量(以鲜质量计)、AsA/DHA和GSH/GSSG比CK显著降低(P<0.05)，降幅分别为15.96%，47.33%，29.39%。低浓度的EBR(50，100，200 μmol/L)可显著提升镉胁迫下的辣椒叶片AsA含量、GSH含量、AsA/DHA和GSH/GSSG(P<0.05)，并显著降低DHA、GSSG含量(P<0.05)，其中，Cd+EBR100处理的效果最为突出，与Cd处理相比，AsA含量显著上升了13.44%，GSH含量显著上升了28.79%，AsA/DHA和GSH/GSSG分别显著上升了54.12%，83.66%，DHA、GSSG含量分别显著下降了26.41%，29.90%。

2.6 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗叶片ROS的影响

2.7 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒叶片基因相对表达量的影响

由图5可知，与CK相比，Cd处理的辣椒叶片中的DHAR、GR、MDHAR、CAT和WRKY25基因表达量均显著提升(P<0.05)，增幅分别为30.67%，21.00%，94.33%，24.67%，433.00%。在镉胁迫下喷施100 μmol/L的表油菜素内酯可显著提高辣椒幼苗叶片中DHAR、MDHAR和WRKY25基因表达量(P<0.05)，增幅分别为17.60%，18.01%，36.84%；喷施100 μmol/L的表油菜素内酯不能显著提升GR和CAT基因的表达量。

3 讨论与结论

3.1 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗生物量和光合色素含量的影响

镉对植物的影响主要表现在两方面，一方面，低浓度的镉离子可激活植物体内H2O2等信号途径，从而加速体内各项生理生化活动[17]；另一方面，高浓度的镉离子会对植物体的正常生长发育和光合作用起到抑制作用，从而降低植物的产量和品质[18]。为了模拟重度镉污染农田对辣椒的生理胁迫，本研究选用了含有高浓度(100 μmol/L)镉离子的营养液培养辣椒幼苗，结果表明，在重度镉胁迫下辣椒幼苗的根长、株高、地上部鲜质量、地下部鲜质量、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均有显著下降(P<0.05)，而在叶面喷施适量的EBR则可有效提升镉胁迫下辣椒生物量和光合色素含量。说明 EBR可以缓解镉胁迫辣椒幼苗生长发育的抑制和对光合色素的降解，有效保护辣椒光合系统，从而提升幼苗对镉胁迫的耐受性。这与Hayat等[19]和俞明宏等[10]在番茄上的研究结果一致。

3.2 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗抗氧化物酶活性的影响

3.3 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗AsA-GSH循环的影响

AsA-GSH循环系统是植物体内清除ROS的重要途径，AsA和GSH均可直接还原ROS，分别形成氧化态的DHA和GSSG，从而完成对ROS的清除。GSH的硫醇基团对镉离子有很高的亲和性，可迅速结合大量的镉离子生成螯合肽，从而降低植物体内镉离子浓度，缓解镉胁迫效应。Aravind等[22]研究表明，AsA 含量少的植物对逆境胁迫更加敏感，长时间的镉胁迫会造成AsA含量显著降低。GR、DHAR和MDHAR是AsA-GSH循环系统的关键酶，其中，GR可将氧化态的GSSG还原为GSH[23]，MDHAR和DHAR可分别将单脱氢抗坏血酸(MDHA)和DHA还原为AsA，从而实现GSH和AsA的循环再生[24]。本研究结果表明，在重度镉胁迫下，辣椒叶片的GR活性、DHAR活性有显著降低(P<0.05)，MDHAR活性略有降低，但差异不显著；GSH、DHA、GSSG含量上有显著升高(P<0.05)，AsA含量、AsA/DHA和GSH/GSSG比CK有显著降低(P<0.05)。说明辣椒在镉胁迫下可通过调高体内GSH含量来螯合镉离子，从而降低镉胁迫对细胞的生理胁迫；但是由于镉离子使得GR和DHAR失活、使得GSSG和DHA无法快速转变为GSH和AsA，造成AsA含量、AsA/DHA和GSH/GSSG的显著降低，ROS的非抗氧化酶系统受到抑制，造成体内ROS的大量积累。同时，本研究结果还表明，添加适量的EBR可显著提升辣椒叶片GR活性、DHAR活性和MDHAR活性(P<0.05)，从而提升AsA含量、GSH含量、AsA/DHA和GSH/GSSG，并显著降低DHA、GSSG含量(P<0.05)。说明EBR可通过激活AsA-GSH循环系统关键酶活性来提升AsA-GSH的循环速率，通过提高AsA-GSH循环系统还原态与氧化态的比例来应对镉离子引起的细胞氧化胁迫。

3.4 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗ROS的影响

3.5 表油菜素内酯对镉胁迫下辣椒幼苗抗逆基因的影响

基因的转录调控是植物应对逆境的重要机制，当植物受到干旱、高温和重金属离子等逆境胁迫时会激发相应信号途径调控下游抗逆基因的表达，增强植物的抗逆能力[26-27]。WRKY家族参与调控植物体内多条激素信号转导途径，与植物逆境响应密切相关，对植物对逆境的抵抗能力具有一定的调控能力[28-30]。Cai等[31]在大豆上筛选出了29个响应镉胁迫的WRKY家族基因，在大豆和拟南芥中超表达GmWRKY142基因后，植株均获得了更强的耐镉性，同时该基因还可调控多个植物激素信号基因的表达。本研究结果表明，重度镉胁迫可显著提高辣椒叶片中的DHAR、GR、MDHAR、CAT和WRKY25基因表达量(P<0.05)，说明高浓度的镉离子可直接或间接激活辣椒体内抗逆基因的表达，来响应过度积累的ROS带来的生理损害，然而高浓度的镉离子占据或替换GR、CAT和DHAR的活性中心，显著降低酶活性，使其无法行使正常功能，从而进一步加剧了胁迫损害。同时，本研究还表明，喷施100 μmol/L的表油菜素内酯可显著提高辣椒幼苗叶片中DHAR、MDHAR和WRKY25基因表达量(P<0.05)，却不能显著提升GR和CAT基因的表达量。说明EBR可有效调控DHAR、MDHAR和WRKY25基因表达，进而提升DHAR、MDHAR的活性，并激活WRKY家族主导的信号通路，提升辣椒对ROS的清除能力和对镉离子的耐受性；而EBR对GR和CAT活性的增强则更有可能作用于翻译后修饰水平，具体调控机制还有待进一步研究。