拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

雷其冬，孙旭东，徐慧妮

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.中国科学院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

TCP4是植物特有的转录因子TCP(Teosinte branched1，cycloidea，proliferating cell factors)家族成员之一，影响多种植物激素的合成，调控植物的生长发育[1]，例如主根、侧根、叶片形态、花蕊形成、表皮毛分化、子叶舒展、下胚轴延伸、避荫反应、植物油脂合成等过程[2]。转录因子TCP4在植物生长发育各个过程中与植物激素信号转导途径中的多种蛋白(如MYB、SAP11)相互作用[3-5]，可能在植物抵抗生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用[5]。在植物发育过程中TCP4还具有时空限制的表达模式，这些表达模式提高了TCP4在局部触发或拮抗激素信号传导的可能性[6]。TCP4具有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，因此,转录因子TCP4能够与功能基因的顺式作用元件结合调控其表达[7]，与其他转录因子相互作用表现为转录抑制和转录激活。近10多年来的研究揭示了部分TCP4的功能和分子机制，但这些研究仍处于初级阶段[8]。

本研究克隆了拟南芥AtTCP4基因，并在大肠杆菌中进行原核表达以获得有蛋白活性的AtTCP4，旨在为进一步揭示TCP4在植物生长发育过程的调控作用和调控靶基因的鉴定奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)种子由中国科学院昆明植物研究所提供，大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞购自上海碧云天生物技术有限公司，载体pET-28a购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 AtTCP4的克隆以及原核表达载体的构建

采用Promega有限公司的Eastep®Super 总RNA提取试剂盒，从拟南芥叶片中提取总RNA，利用EvaGreen 2×qPCR MasterMix-ROX试剂盒反转录获得cDNA。根据拟南芥基因组数据库TCP4序列(基因登录号AT3G15030)，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计特异性引物，EZ-TCP4-EcoRⅠ-F：CGCGGATCCGAATTCATGTCTGACGACCAA，EZ-HindⅢ-R：TGCGGCCGCAAGCTTTCAATGGCGAGAAAT，利用南京诺唯赞生物科技股份有限公司Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒对TCP4进行扩增。RT-PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min，12 ℃ ∞。RT-PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳并胶回收纯化(Omega Bio-Tek公司 E. Z. N. A®Gel Extraction Kit试剂盒)。采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司同源重组试剂盒，并加入TCP4胶回收片段以及pET-28a载体双酶切产物进行连接，将重组表达载体转化至E.coliDH5α 感受态细胞中，进行菌落PCR和质粒酶切验证，然后将阳性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 重组菌株pET-28a-AtTCP4的诱导和表达

将测序正确的重组质粒 pET-28a-AtTCP4转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，取1 μL重组菌株菌液接种到3 mL LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min过夜活化。将活化后菌液吸取100 μL再接种到10 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600=0.8。加入1 mmol/L IPTG，28 ℃诱导4 h或18 ℃过夜诱导表达。各取2 mL菌液，离心收集菌体。加入60 μL的蛋白Loading Buffer吹打混匀，沸水浴5～10 min，冰上冷却1 min，离心进行电泳分析。

1.4 蛋白纯化

采用Promega公司Magne HisTMProtein Purification System试剂盒纯化蛋白。将细胞沉淀重悬于100 μL Fast BreakTM细胞裂解液中，室温涡旋孵育2 h。加入30 μL Magne HisTMNi颗粒，4 ℃涡旋孵育 2 h，确保Magne HisTMNi颗粒混合均匀。试管放置磁力架中约30 s，以捕获Magne HisTMNi颗粒，弃上清液。加入150 μL Magne HisTM洗涤缓冲液，颠倒混匀，弃上清液。重复洗涤3次。加入洗脱缓冲液100 μL，室温静止1～2 min，放置在磁力架中约30 s，吸取含有纯化蛋白的上清液。进行SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝染液验证是否纯化成功。

1.5 Western Blot检验目的蛋白

样品加入等体积蛋白Loading Buffer，煮沸5 min，冰上冷却1 min，12 000 r/min、离心1 min[9]，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白后，转PVDF膜，使用His抗体通过免疫印迹法检测蛋白[10]。

1.6 EMSA分析

从NCBI数据库中查询LOX2基因启动子序列，通过PLANT CARE网站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析其启动子序列是否有bHLH结构域结合位点，确认LOX2基因启动子序列含有转录因子TCP4顺式作用元件。由上海捷瑞生物工程有限公司设计探针和竞争性探针，采用化学发光法EMSA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)验证TCP4蛋白与探针的结合。

2 结果与分析

2.1 转录因子AtTCP4生物信息学分析

通过拟南芥基因组数据库TAIR(https：//www.arabidopsis.org/)查询转录因子AtTCP4基因序列以及蛋白序列，对转录因子TCP家族进行蛋白序列比较以及构建系统发育进化树，其结果见图1-A、B。拟南芥TCP家族基因编码区由Basic、Helix Ⅰ、Loop和Helix Ⅱ结构域构成，因此，转录因子TCP4能够与功能基因的顺式作用元件结合调控其表达。根据结合位点碱基序列不同，将TCP家族分为两大类：Ⅰ类(GGNCCCAC)和Ⅱ类(GTGGNCC)。Ⅱ类又分为CYC/TBI、CIN两大类，CIN包括TCP10、TCP3、TCP4、TCP2、TCP24、TCP13、TCP5、TCP17。对TCP4蛋白进行三级结构预测，其结果见图1-C。转录因子TCP4可以形成同源二聚体，与水稻转录因子PCF6三级结构相似度高达70.04%。

2.2 AtTCP4基因克隆以及原核载体构建

从野生型拟南芥中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计特异性引物对AtTCP4进行扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳，获得1 200 bp 左右的特异性条带(图2-A)，与AtTCP4开放阅读框长度相同。对其进行胶回收、纯化，连接到pET-28a载体，转入大肠杆菌DH5α筛选培养后进行菌落PCR验证(图2-B)，获得阳性重组子。对阳性质粒测序进一步证实目的基因已连接到pET-28a质粒，表明成功构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4。

2.3 重组菌株pET-28a-AtTCP4的诱导和表达

将测序正确的重组质粒 pET-28a-AtTCP4转化到Rosetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落进行PCR，鉴定阳性菌株。将含重组质粒 pET-28a-AtTCP4的菌株在37 ℃摇床摇至OD600=0.8，加入1 mmol/L IPTG、28 ℃诱导4 h或18 ℃过夜诱导表达。

将IPTG诱导表达的菌液进行4 ℃、10 000 r/min离心，弃上清液，收集沉淀。加入60 μL的蛋白Loading Buffer吹打混匀沸水浴5～10 min，置于冰上冷却1 min，离心提取总蛋白，进行电泳分析。SDS-PAGE 电泳检测，在约75 ku 位置出现一条明显的蛋白条带(图3-A)。采用Promega公司Magne HisTMProtein Purification System试剂盒纯化AtTCP4蛋白，SDS-PAGE 电泳检测，在约75 ku 位置出现单一的蛋白条带(图3-B)。

2.4 Western Blot检测AtTCP4蛋白

将诱导表达后的蛋白经过Magen HisTMProtein Purification System试剂盒纯化，SDS-PAGE电泳后转移到 PVDF 膜上进行Western Blot 检测，在75 ku位置处出现了目的蛋白，与预期一致(图4)。将纯化的AtTCP4蛋白冻存于-80 ℃。

2.5 转录因子AtTCP4与LOX2基因启动子区域结合

根据顺式作用元件设计探针和竞争性探针，凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与探针结合情况，结果如图5所示，AtTCP4蛋白与探针结合，当加入竞争性探针后，条带变暗。证实转录因子AtTCP4与LOX2基因启动子区域结合。

3 讨论

TCP家族是保守的转录因子家族，对拟南芥TCP家族进行多序列比对，TCP家族基因编码区是由55～59个氨基酸组成的非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域。水稻转录因子OsTCP家族在140～240位置包含一个bHLH结构域[11]。Liu等[12]通过系统发育分析表明，TCP家族基因在陆生植物之间具有保守性。番茄基因组中有30个SlTCP基因，蛋白多序列比对和系统发育树将转录因子SlTCP家族分为Ⅰ类和Ⅱ类。Ⅰ类的TCP结构域相比Ⅱ类缺少4个氨基酸[13]。Ⅱ类TCP家族含有一个富含精氨酸的残基基序(R结构域)[14]和一个谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸伸展结构域[15]，其功能是未知的。根据结合位点碱基不同，可将拟南芥TCP蛋白分为Ⅰ类和Ⅱ类。正是因为结合位点碱基不同，转录因子TCP与顺式作用元件结合具有多样性，能够调控更多功能基因的表达，参与植物生理生化过程，响应外界刺激调控植物生长发育[16]。TCP蛋白可以形成同源二聚体和异源二聚体，但异源二聚体比同源二聚体更有效结合到DNA启动子区域。因此，同源或异源二聚体识别顺式调控元件时具有不同的亲和力，所以功能基因的表达量也有所不同[17]。这会使调控网络具有复杂性和特异性。

研究表明，拟南芥AtTCP4主要在子叶和幼叶中表达并调节这些组织器官的形态[18]，还可与一些功能基因的顺式作用元件结合，调控多种植物激素的合成，从而参与植物生长发育过程。在JA信号途径中，Lipoxygenase2(LOX2)基因受TCP转录因子的调控，该基因编码参与由α-亚麻酸合成 JA途径的叶绿体酶，LOX2的诱导使JA积累最终促进叶片衰老[19]。本研究通过构建原核载体，诱导纯化获得AtTCP4蛋白。利用EMSA试验验证了转录因子TCP4能够结合到LOX2基因的启动子区域，调控LOX2基因的表达，从而参与植物激素的合成。AtTCP4蛋白的获得为进一步了解其蛋白结构提供试验材料，同时为蛋白质伴侣的鉴定和其他下游功能基因的确定奠定了基础[20]。